熒光顯微鏡是一種用于可視化

在這個(gè)指導(dǎo)中，我將回顧熒光顯微鏡的基本原理以及如何構(gòu)建三個(gè)不同的低成本熒光顯微鏡。這些系統(tǒng)通?；ㄙM(fèi)數(shù)千美元，但最近有一些努力使它們更容易獲得。我在這里介紹的設(shè)計(jì)采用智能手機(jī)，dSLR和USB顯微鏡。所有這些設(shè)計(jì)也可用作明場(chǎng)顯微鏡。讓我們開始吧！

第1步：熒光顯微鏡概述

要了解熒光顯微鏡的基本概念，想象一下夜晚的茂密森林，樹木，動(dòng)物，灌木叢以及其他生活在森林中的森林。如果您將手電筒照射到森林中，您會(huì)看到所有這些結(jié)構(gòu)，并且很難想象出特定的動(dòng)物或植物。假設(shè)您只對(duì)在森林中看到藍(lán)莓灌木感興趣。要做到這一點(diǎn)，你要訓(xùn)練螢火蟲只被藍(lán)莓灌木叢所吸引，這樣當(dāng)你看著森林時(shí)，只有藍(lán)莓灌木叢才會(huì)亮起來(lái)。你可以說(shuō)你用螢火蟲標(biāo)記藍(lán)莓灌木叢，這樣你就可以看到森林里的藍(lán)莓結(jié)構(gòu)。

在這個(gè)類比中，森林代表了整個(gè)樣本，藍(lán)莓灌木代表您想要可視化的結(jié)構(gòu)（例如特定細(xì)胞或亞細(xì)胞器），螢火蟲是熒光化合物。在沒(méi)有螢火蟲的情況下單獨(dú)照射手電筒的情況類似于明視場(chǎng)顯微鏡。

下一步是了解熒光化合物（也稱為熒光團(tuán)）的基本功能。熒光團(tuán)實(shí)際上是小型物體（納米尺度），設(shè)計(jì)用于連接樣品中的特定結(jié)構(gòu)。它們吸收窄范圍波長(zhǎng)的光并重新發(fā)射另一波長(zhǎng)的光。例如，一個(gè)熒光團(tuán)可以吸收藍(lán)光（即熒光團(tuán)被藍(lán)光激發(fā)），然后重新發(fā)射綠光。通常這通過(guò)激發(fā)和發(fā)射光譜來(lái)概括（上圖）。這些圖表顯示了熒光團(tuán)吸收的光的波長(zhǎng)和熒光團(tuán)發(fā)射的光的波長(zhǎng)。

顯微鏡設(shè)計(jì)與普通明場(chǎng)顯微鏡非常相似，有兩個(gè)主要差異。首先，照射樣品的光必須是激發(fā)熒光團(tuán)的波長(zhǎng)（對(duì)于上面的例子，光是藍(lán)色的）。其次，顯微鏡只需要收集發(fā)射光（綠光），同時(shí)阻擋藍(lán)光。這是因?yàn)樗{(lán)光到處都是，但綠光只來(lái)自樣品中的特定結(jié)構(gòu)。為了阻擋藍(lán)光，顯微鏡通常會(huì)有一種稱為長(zhǎng)通濾光片的東西，讓綠光在沒(méi)有藍(lán)光的情況下通過(guò)。每個(gè)長(zhǎng)通濾波器都具有截止波長(zhǎng)。如果光的波長(zhǎng)比截止波長(zhǎng)，則它可以通過(guò)濾波器。因此，名稱，“長(zhǎng)途通行證”。更短的波長(zhǎng)被阻擋。

第2步：用光學(xué)光學(xué)建模顯微鏡

這是一個(gè)額外的步驟設(shè)計(jì)顯微鏡的基本原則。沒(méi)有必要構(gòu)建熒光顯微鏡，因此如果您不想深入研究光學(xué)，可以跳過(guò)它。

明場(chǎng)和熒光顯微鏡都可以使用射線光學(xué)器件建模。射線光學(xué)的基本前提是光的行為類似于遠(yuǎn)離光源傳播的光線。當(dāng)你環(huán)顧房間時(shí)，你會(huì)看到窗外的陽(yáng)光或者燈泡所帶來(lái)的光線。然后光被房間中的物體吸收或反射。一些反射光會(huì)使它朝向你的眼睛。如果物體被照亮，您可以想象物體上的每個(gè)點(diǎn)在所有方向上發(fā)射光線（上圖）。鏡頭，就像我們眼中的鏡頭一樣，將光線聚焦到一點(diǎn)，這樣我們就能看到物體。沒(méi)有鏡頭，光線繼續(xù)向外傳播，不會(huì)形成圖像。

那么我們?nèi)绾沃谱鞣糯笮∥矬w的光學(xué)系統(tǒng)呢？為了理解設(shè)計(jì)，你真的只需要知道兩個(gè)方程：薄透鏡成像和放大方程：

1/f = 1/si + 1/so

M = -si/so

f是鏡頭的焦距。較短的焦距意味著鏡頭具有更多的聚焦能力。

對(duì)象距離也是如此;鏡頭和物體之間的距離（例如樹）。

si是圖像距離;鏡頭與圖像形成位置之間的距離

M是放大率;圖像相對(duì)于對(duì)象有多大。對(duì)于顯微鏡，我們想要增加放大倍數(shù)。

有關(guān)薄透鏡方程的完整教程，請(qǐng)查看此Khan Academia視頻。在上面的gif中，您可以看到物體移近鏡頭的距離會(huì)增加圖像距離，從而增加放大倍率。帶有兩個(gè)箭頭的垂直線表示鏡頭。

宏觀攝影 - dSLR設(shè)計(jì)1

從這些方程式中，我們可以看到，如果我們使用單鏡頭，然后放大圖像的方式是增加圖像距離。這是通過(guò)將鏡頭遠(yuǎn)離傳感器移動(dòng)相機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。許多DIY微距攝影都是通過(guò)使用擴(kuò)管器簡(jiǎn)單地移出鏡頭來(lái)完成的。這是一個(gè)很好的技巧，為昂貴的宏觀透鏡提供了便宜的替代品。要增加放大倍率，您還可以減小鏡頭的焦距。翻轉(zhuǎn)鏡頭的原因稍微復(fù)雜一些，需要了解光學(xué)系統(tǒng)的主平面。如果您正在尋找解釋，請(qǐng)告訴我們！

USB顯微鏡

USB顯微鏡以相同的方式工作。它們經(jīng)過(guò)專門設(shè)計(jì)，可以非?？拷R頭拍攝物體。物體越接近鏡頭，放大倍數(shù)越大。它們還有幾個(gè)可以移動(dòng)的鏡頭元件，讓您可以在不同的距離聚焦，類似于變焦鏡頭。除了使用的鏡頭系統(tǒng)，它們與網(wǎng)絡(luò)攝像頭非常相似。

智能手機(jī)設(shè)計(jì)

對(duì)于智能手機(jī)，圖像距離是固定的（即您無(wú)法移動(dòng)鏡頭）。那么我們?cè)趺窗阉D(zhuǎn)換成顯微鏡呢？如果重新排列上面的等式，您會(huì)發(fā)現(xiàn)通過(guò)縮短鏡頭的焦距可以增加放大倍率：M = si/f -1。打開手機(jī)更換相機(jī)鏡頭并不是最好的選擇，因此您可以在手機(jī)外面添加雙凸透鏡。通過(guò)添加另一個(gè)鏡頭，可以減少鏡頭系統(tǒng)的有效焦距。我見過(guò)人們使用一次性相機(jī)鏡頭和激光指示鏡頭。

無(wú)限遠(yuǎn)校正顯微鏡 - dSLR設(shè)計(jì)2

我走的最終設(shè)計(jì)在這個(gè)教學(xué)中，與實(shí)驗(yàn)室中的顯微鏡設(shè)計(jì)最為相似。設(shè)計(jì)中有兩種鏡頭系統(tǒng)：物鏡和鏡筒。物鏡是最接近樣品的組分。將樣品放置在焦平面處，使得物鏡外的光實(shí)際上不形成圖像（即，si =無(wú)窮大）。圖像由管透鏡形成在傳感器上。該系統(tǒng)的放大倍數(shù)由物鏡和鏡筒焦距的比值給出。以下是有關(guān)具有此設(shè)計(jì)的明場(chǎng)顯微鏡的更多信息的視頻。

步驟3：供應(yīng)清單

所有設(shè)計(jì)

耗材

激發(fā)LED：WS2801/WS2811或高功率藍(lán)光LED

長(zhǎng)通濾波器：Thorlabs，Edmund光學(xué)器件，Ealing，昂貴選項(xiàng)：Semrock

幫助保持濾波器

準(zhǔn)備好的顯微鏡載玻片

Arduino Nano

按鈕

1kOhm電阻器

4X M3x12螺栓

4X M3螺母

堅(jiān)固的塑料或蓋玻片

熒光染料（例如熒光筆墨水） ，熒光素，還是這個(gè)？）

工具：

適配器的3D打印機(jī)

電鉆

熱膠槍

塑料移液器

剪刀

艾倫扳手

LED燈條的烙鐵

1。智能手機(jī)設(shè)計(jì)

智能手機(jī);我使用了我的iPhone 5s

一次性相機(jī)鏡頭，激光指示鏡頭或光點(diǎn)鏡頭

智能手機(jī)座

2。 USB攝像頭設(shè)計(jì)

USB顯微鏡

6mm直徑磁鐵

3。 dSLR設(shè)計(jì)

dSLR;我使用了我的尼康D5000

管鏡頭; 180毫米消色差雙合透鏡

無(wú)限校正物鏡

2英寸直徑鏡頭管

安裝到SM2適配器

擋圈

步驟4：構(gòu)建燈具

熒光顯微鏡的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別是光源。熒光顯微鏡代替在明視場(chǎng)顯微鏡中使用的白光（即許多波長(zhǎng)），需要特定顏色的光（即窄波長(zhǎng)范圍）。例如，藍(lán)光的波長(zhǎng)約為488nm。

我決定用可尋址的LED條構(gòu)建熒光顯微鏡，以便在熒光和明場(chǎng)成像之間切換。該支架設(shè)計(jì)用于我在這個(gè)教學(xué)中展示的所有三種顯微鏡設(shè)計(jì)。我在Fusion360中設(shè)計(jì)了它，然后3D打印了三個(gè)部分。安裝座向內(nèi)傾斜LED，以最大化入射到樣品上的光。在gif中，您可以看到它如何與USB顯微鏡集成。對(duì)于其他顯微鏡，它只是固定LED。

首先將一個(gè)M3螺母添加到黑色LED支架的插槽中，然后滑入M3x12螺栓。螺栓和螺母用作固定螺絲，將USB顯微鏡固定到位。接下來(lái)，從W2801或WS2811 LED燈條上切下8個(gè)LED，然后將LED推入孔中。將紅色電纜連接到5V，藍(lán)色電纜連接到Gnd，白色電纜（數(shù)據(jù)）連接到D2。對(duì)于顯微鏡我想循環(huán)幾種顏色，所以我添加了一個(gè)連接到D3針的按鈕。附件是運(yùn)行光源的代碼。

接下來(lái)，在灰色LED底座的狹縫中添加四個(gè)M3螺母，并將LED組件放在頂部。添加蓋板，滑入M3螺栓，然后用通用扳手?jǐn)Q緊。然后可以將整個(gè)組件安裝到具有圓形底部的黑色底座上。

步驟5：準(zhǔn)備熒光樣本

也許熒光顯微鏡中最棘手的部分是制作標(biāo)記樣品。挑戰(zhàn)在于將熒光團(tuán)僅用于特定結(jié)構(gòu)，這是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)過(guò)程。您可以訂購(gòu)熒光載玻片，就像這些小鼠腎臟載玻片一樣，但它們很貴。校準(zhǔn)載玻片也可用，可用于驗(yàn)證熒光顯微鏡。

要自行制作低成本熒光燈，您需要熒光燈（例如熒光筆液，熒光素等），硬塑料（或蓋玻片），透明膠帶，塑料移液器和吸收溶液的材料。將幾滴熒光溶液添加到想要在圖像中發(fā)光的結(jié)構(gòu)中。在我的例子中，我正在標(biāo)記一些紗線。將物體放在紙巾上以吸收excel液體。請(qǐng)記住，您不希望熒光液進(jìn)入樣品中的任何其他物質(zhì)！

一旦確定標(biāo)簽物是干燥的，將其添加到蓋玻片上的其余樣品中。我加了一張沒(méi)有熒光液的薄紙。您可以使用一塊硬塑料切割成蓋玻片，而不是蓋玻片。用膠帶將樣品貼在蓋玻片上。您現(xiàn)在已準(zhǔn)備好對(duì)熒光樣品進(jìn)行成像！請(qǐng)注意，熒光溶液可能會(huì)變干并且隨著時(shí)間的推移也不會(huì)起作用。

我必須制作熒光樣品的另一個(gè)想法是將花放入熒光溶液中。熒光溶液將穿過(guò)植物的靜脈并標(biāo)記它們。以下是有關(guān)熒光花的更多信息。

步驟6：智能手機(jī)熒光顯微鏡

從一次性相機(jī)中取出鏡頭，然后使用3D打印機(jī)支架將鏡頭滑過(guò)智能手機(jī)。如果您沒(méi)有3D打印機(jī)，只需將鏡頭邊緣粘貼到手機(jī)上即可。甚至還有專為智能手機(jī)顯微鏡設(shè)計(jì)的更好的鏡頭，您也可以從Smart Micro Optics購(gòu)買。

通過(guò)這種簡(jiǎn)單的設(shè)置，您手中已經(jīng)擁有了一臺(tái)超棒的數(shù)字明場(chǎng)顯微鏡。以下是構(gòu)建這些類型顯微鏡的更多資源。上面你可以看到我使用一次性相機(jī)鏡頭和iPhone5s拍攝的一些照片。如果您想了解其工作原理，請(qǐng)查看步驟3.

現(xiàn)在進(jìn)入熒光顯微鏡。將智能手機(jī)安裝在三腳架上，然后將光源放在智能手機(jī)后面。將熒光樣品放在智能手機(jī)和光源之間。最后，使用幫助手在樣品和智能手機(jī)之間移動(dòng)過(guò)濾器。濾光片將阻擋藍(lán)色激發(fā)光。

用這臺(tái)顯微鏡拍攝的明場(chǎng)結(jié)果確實(shí)令人印象深刻，但我對(duì)熒光成像感到失望。主要問(wèn)題是iPhone的自動(dòng)色彩和曝光校正。如果不控制這些功能，整個(gè)框架將變?yōu)樗{(lán)綠色，熒光標(biāo)記的字符串不會(huì)彈出?？赡苡幸粋€(gè)解決辦法，因?yàn)槲野l(fā)現(xiàn)了青山衛(wèi)和Aydogan Ozcan的這款智能手機(jī)熒光顯微鏡。

步驟7：USB熒光顯微鏡

首先，您需要3D打印過(guò)濾器支架。 STL文件如下。所有膠水磁鐵都朝向與過(guò)濾器支架相同的方向。然后在與固定LED的安裝座相反的方向上粘貼磁鐵。當(dāng)這兩個(gè)組件都放在LED底座中時(shí)，它們將過(guò)濾器鎖定到位。將USB顯微鏡滑入LED安裝座并擰緊固定螺釘。您還可以在USB顯微鏡周圍添加畫家的膠帶，以確保緊密貼合。

要在明場(chǎng)和熒光顯微鏡之間切換，請(qǐng)滑動(dòng)過(guò)濾器支架。長(zhǎng)通濾波器將位于USB顯微鏡前面，用于熒光成像。然后打開LED燈條，使右側(cè)激發(fā)燈亮（可能是藍(lán)光）。現(xiàn)在滑入熒光樣品并保存一些圖像。我使用Mac上的Digital Viewer程序來(lái)使用USB顯微鏡。以上是一些例子。我對(duì)結(jié)果印象非常深刻！

步驟8：DSLR顯微鏡

最終設(shè)計(jì)提供最高放大倍率和最佳質(zhì)量，但它是最昂貴。將Fmount-to-SM2適配器添加到dSLR，然后擰入2“和3”管擴(kuò)展器。然后安裝180毫米消色差雙合透鏡。在物鏡蓋上鉆一個(gè)孔，使光可以通過(guò)，然后將其推入自定義物鏡到SM2適配器（STL文件在上面）。在鏡筒后添加一個(gè)3英寸，2英寸和1.5英寸的擴(kuò)管器，然后是物鏡。

接下來(lái)，您需要將相機(jī)牢固地放在桌子上，然后是長(zhǎng)通濾鏡，樣品和光源。我在我的CT掃描儀項(xiàng)目中使用了我的dSLR安裝（參見那個(gè)instructable的第5步），但你也可以使用三腳架?？梢允褂弥謱⑦^(guò)濾器固定到位。將濾光片移開以進(jìn)行明場(chǎng)成像。上面的前兩個(gè)示例圖像是相同的樣本，一個(gè)在明場(chǎng)模式，另一個(gè)在熒光模式。注意結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別！我認(rèn)為這是熒光顯微鏡有用的最好例子。如果樣本標(biāo)記良好，您可以將特定結(jié)構(gòu)可視化并將其他所有內(nèi)容清除。

處理圖像的另一個(gè)技巧是簡(jiǎn)單地調(diào)高對(duì)比度。您可以在上面包含明場(chǎng)和熒光圖像的兩幅圖像中看到。

步驟9：顯微鏡比較

以上是熒光和明場(chǎng)成像結(jié)果的幾個(gè)并列比較。 dSLR設(shè)計(jì)具有最佳的分辨率，對(duì)比度和整體圖像質(zhì)量，但是最昂貴。我認(rèn)為USB顯微鏡是使熒光顯微鏡啟動(dòng)和運(yùn)行的最佳整體方案。唯一的主要成本是長(zhǎng)通濾波器，大約60美元。我仍在尋找更便宜的替代品來(lái)降低顯微鏡的總體成本。我對(duì)iPhone的結(jié)果感到有些失望，但如果我可以手動(dòng)調(diào)整曝光和色彩校正（任何想法？），這個(gè)設(shè)計(jì)可能會(huì)有所改進(jìn)。

USB顯微鏡上的焦點(diǎn)旋鈕也可以使成像成像與dSLR相比，它更容易，這需要精細(xì)移動(dòng)樣品。有高精度線性平臺(tái)可用，但我能找到的至少是100美元。我使用卡尺制作了一個(gè)廉價(jià)線性舞臺(tái)的原型，但沒(méi)有在這個(gè)教學(xué)中顯示出來(lái)。 MyPhotonics提出了一些由樂(lè)高制作的精彩翻譯舞臺(tái)設(shè)計(jì)。我沒(méi)有試過(guò)它們，但它們看起來(lái)像是另一個(gè)很好的低成本解決方案。

審核編輯 黃昊宇