再生是組織修復的“必殺技”，但皮膚損傷通常會產(chǎn)生纖維化的、無功能的疤痕。疤痕是指皮膚損傷后的纖維化，通過用非功能性結(jié)締組織替代功能性組織來確保傷口能夠盡快愈合。由于疤痕沒有皮膚的毛發(fā)或腺體，因此也不具有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來的醫(yī)療負擔巨大，但目前尚無有效的治療方法，部分原因是缺乏對再生和纖維化愈合的基本機制的了解。所以想要發(fā)展促再生療法，需要深刻理解從損傷到纖維化或再生的分子軌跡。

近日，美國斯坦福大學醫(yī)學院研究組在Cell Stem Cell（IF：24.633）上發(fā)表了一篇題為Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing的文章，該研究以單細胞多組學方式（單細胞轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組）描繪了YAP抑制背景下瘢痕與傷口再生的分子軌跡。 研究發(fā)現(xiàn)，使用YAP (Yes-associated protein) 抑制劑可以防止成纖維細胞纖維化，并產(chǎn)生ENF (En-1-negative fibroblasts) 介導的再生，這一過程包括真皮附件如毛囊 (HF) 和腺體的恢復、細胞外基質(zhì) (ECM) 的結(jié)構(gòu)與未發(fā)生損傷皮膚 (UW) 的結(jié)構(gòu)相同以及具有相似的彈性。

纖維化和再生創(chuàng)傷的多模態(tài)分析

研究分析了7個時間點的小鼠創(chuàng)面和皮膚：UW皮膚、術(shù)后第2天（炎癥期）、術(shù)后第7天（成纖維細胞增殖期）、術(shù)后第10天、術(shù)后第14天（傷口重新上皮化、成纖維細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)）、術(shù)后第21天和術(shù)后第30天（成纖維細胞重塑ECM）。采用夾板切除傷口模型，該模型能夠防止皮膚松弛小鼠典型的傷口快速收縮，從而可以對傷口恢復過程進行監(jiān)控。傷后立即在創(chuàng)面注射YAP抑制劑或?qū)φ站彌_液，對傷口進行長時程多模分析。 對照組創(chuàng)面形成明顯的纖維瘢痕，有密集、線性排列的ECM纖維，無毛囊和腺體；而YAP抑制劑處理后的創(chuàng)面，有毛囊和腺體再生，ECM纖維密度較低，且生長方向更隨機。通過YAP敲除對該結(jié)果進行再次確認，抑制劑與對照組之間處理的差異并非由于抑制劑的脫靶效應(yīng)引起。 根據(jù)FACS策略進行細胞分類，分離成纖維細胞(Lin-) 和其他細胞 (主要是免疫細胞；Lin+)。對一半的細胞進行scRNA-seq分析，總計2986個細胞。發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在YAP抑制劑處理的創(chuàng)面中輕微增加；然而，對照組和YAP抑制劑創(chuàng)面的細胞比例大體相似，這表明YAP、抑制劑可能通過改變細胞表型而不是相對表征（或通過改變細胞類型中的亞群表征）來誘導再生。剩余的細胞進行蛋白質(zhì)組學分析（timsTOF質(zhì)譜分析）。主成分分析發(fā)現(xiàn)Lin-和Lin+蛋白組學標本在不同時間點上差異很大，而PBS樣本和YAP抑制劑樣本的差異則比較狹窄，這表明蛋白質(zhì)組學分析可以在更廣泛的修復動力學中捕獲連貫的纖維化變化。

疤痕形成與再生創(chuàng)面修復的多模態(tài)分析

(B)創(chuàng)傷愈合隨時間變化的小鼠配對多模態(tài)分析實驗策略。

(C)按細胞類型（左上）、處理組（右上）、小鼠個體（左下）和POD（右下）著色的scRNA-seq細胞的多重投影。

(D)PBS和維替泊芬（YAP抑制劑）處理的傷口按時間點的細胞類型比例。

(E)Lin-（成纖維細胞，上）和Lin+（非成纖維細胞，下）細胞。

(F)頂部，量化294個ECM參數(shù)的圖像處理和分析管道示意圖輪廓。底部為對照（左）和椎體芬（右）傷口隨時間的t-SNE圖。綠色陰影區(qū)域，UW皮膚簇；疊加箭頭，ECM隨時間演化。

識別修復的分子軌跡

因為成纖維細胞是瘢痕形成的主要驅(qū)動因素，研究假設(shè)YAP抑制劑通過改變成纖維細胞表型促進再生，并將scRNA-seq分析集中在成纖維細胞上。單細胞分析發(fā)現(xiàn)再生過程和纖維化過程并不是相互排斥的，具有促再生活性的細胞可能存在于瘢痕創(chuàng)面之中，但是在沒有干預(yù)的情況下（例如YAP抑制劑處理），促纖維化分子的反應(yīng)會覆蓋再生的活性，并導致纖維化瘢痕表型。 此外，還分析了另外兩種與傷口相關(guān)的細胞亞群：骨髓細胞和淋巴細胞。髓系細胞假時間分析顯示，炎癥基因（如Ccl6、Ccl9和Cxcl2）在早期富集，抗原呈遞基因（如H2復合物）在后期富集。然而，這些基因在PBS和YAP抑制劑細胞中表達相似，表明該分析沒有區(qū)分纖維化和再生愈合。淋巴樣細胞假時間分析也沒有區(qū)分纖維化和再生的傷口，而是分別反映了早期和晚期的NK和B/T細胞浸潤。發(fā)現(xiàn)抑制劑處理與對照組相比，免疫細胞的組成并沒有出現(xiàn)太大的差異。因此，疤痕表型是否產(chǎn)生并非是由于免疫細胞的差異，其原因可能還是主要集中在成纖維細胞之中。 使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)。CellChat強調(diào)了再生臂中涉及疤痕 (PBS) 成纖維細胞和非典型Wnt信號的促炎信號（如CXCL和IL6）的增加。這些獨特的功能富集項，以及該組中較低的Dpp4表達，暗示了由非瘢痕性ENF設(shè)計的獨特的分子愈合軌跡。

成纖維細胞相互作用的CellChat分析

(A)細胞群對間配體-受體相互作用的強度。邊緣寬度與配體-受體對的數(shù)量成正比。

(B)如(A)中，按細胞種群劃分的子集。

(C)熱圖顯示了基于指定信號網(wǎng)絡(luò)(ncWNT, noncanonical Wnt)的計算網(wǎng)絡(luò)中心性度量的每個細胞群的相對重要性。

(D和E)推斷出的分泌細胞輸出(D)和輸入(E)通信模式，顯示出推斷出的潛伏模式和細胞群之間的對應(yīng)關(guān)系(左)和信號通路(右)。

傷口纖維化和再生軌跡標記物的研究

基于綜合多模態(tài)分析，試圖驗證不同創(chuàng)傷表型中關(guān)鍵基因的相關(guān)性。圖譜中差異表達的基因指向了Wnt信號通路，包括Wnt的靶標基因、拮抗基因以及一個重要的調(diào)節(jié)因子Trps1。先前的研究表明Trps1是Wnt信號通路的主要調(diào)節(jié)因子，且與皮膚腺體的發(fā)育、生長和增殖相關(guān)。通過Trps1基因敲除以及過表達實驗，研究確認該基因?qū)τ趥谠偕潜匾页浞值?。支持了ENF介導的愈合（低Dpp4）在YAP抑制（低Ankrd1）的傷口中通過Wnt激活（高Trps1和Rspo1）實現(xiàn)HF再生這一發(fā)現(xiàn)。

確定Trps1在再生中的功能意義

鑒于Trps1在Wnt信號轉(zhuǎn)導、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)控中的重要性，以及Trps1+成纖維細胞和HF再生的空間關(guān)系，研究試圖確定Trps1在創(chuàng)面再生中的作用。綜合多模態(tài)分析區(qū)分了兩種修復軌跡。第一種是EPF介導的 (Dpp4+)，以機械激活（高核YAP，Ankrd1+，Trps1-）為特征，導致疤痕ECM。二是ENF介導 (Dpp4-)，缺乏機械活化（低核YAP，Ankrd1-，Trps1+），并通過Wnt激活導致正常ECM和HF的再生。 總結(jié)一下，該研究通過對傷口再生進行YAP抑制劑處理后的長時程多模分析，建立了傷口再生的分子生物學、細胞生物學以及蛋白質(zhì)圖譜，對研究皮膚傷口再生與纖維化瘢痕形成的阻斷具有重要價值。 審核編輯：郭婷