病原體循環(huán)標志物的檢測對于疾病的診斷和治療監(jiān)控意義重大，但由于免疫復(fù)合物導(dǎo)致的屏蔽作用，以及不同病原體蛋白質(zhì)與抗體間的的交叉反應(yīng)，傳統(tǒng)免疫測定法的靈敏度和特異性較差。通過質(zhì)譜方法對標志物蛋白中序列特異的多肽檢測可以很好的解決上述問題，甚至是對由于微小序列突變蛋白，或者是不同亞型細菌/病毒引發(fā)的疾病進行分型。然而，質(zhì)譜檢測需要相對昂貴的設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，因此不利于在傳染病經(jīng)常流行的、但資源有限的發(fā)展中地區(qū)廣泛推廣。

為了解決這些問題，來自杜蘭大學(xué)的胡曄教授課題組致力于尋求使用納米孔作為質(zhì)譜的經(jīng)濟替代技術(shù)的可能性，并將該技術(shù)用于臨床樣本中多肽生物標志物的精準識別和檢測。基于納米孔的傳感器可以在特定的施加電壓、pH和鹽濃度產(chǎn)生特征離子電流，并且該信號會在特定分子的相互作用產(chǎn)生非常敏感和特異的信號變化，從而形成對應(yīng)于特定靶標特異的特征譜。這種原理已經(jīng)在核酸檢測和測序中被廣泛應(yīng)用。最近的研究還表明，由肽-納米孔相互作用產(chǎn)生的特征信號實現(xiàn)多肽標準品的精準鑒定。然而，由于臨床樣本成分的復(fù)雜性，基于納米孔的多肽傳感器在臨床實際應(yīng)用中的可行性仍有待探索。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，為了填補基礎(chǔ)研究和臨床納米孔應(yīng)用之間的這一空白，近期，胡曄團隊在Nano Today上發(fā)表了文章“Nanopore-based disease diagnosis using pathogen-derived tryptic peptides from serum”，開發(fā)了一種方法實現(xiàn)實際樣品中與疾病相關(guān)多肽的檢測。

研究人員首先運用理化性質(zhì)分析預(yù)測出高度抗原性的多肽序列，這種序列的多肽不僅可以和疾病高度相關(guān)，還可以與納米孔相互作用產(chǎn)生特異性的信號。接著，研究人員進一步篩選純化出對該多肽具有高度親和力的單克隆抗體。通過對血清樣本進行簡單的胰蛋白酶消化處理，該抗體便可以通過免疫沉淀的過程在血清樣本中高效的富集、純化和回收靶標多肽。隨后，研究人員利用定制的算法對靶標多肽與納米孔相互作用產(chǎn)生的電信號進行鑒定和統(tǒng)計學(xué)分析，并且確定了具有特定的峰值電流和滯留時間的高度獨特的特征信號譜，實現(xiàn)了在寬的線性范圍內(nèi)對靶標多肽的檢測。

多肽分析結(jié)合免疫純化技術(shù)實現(xiàn)納米孔在臨床疾病診斷中的應(yīng)用

此外，研究人員還進一步研究了幾種可能影響納米孔傳感器開發(fā)的主要臨床干擾物，并優(yōu)化了樣品制備步驟以去這些干擾物對于測量的影響。以結(jié)核病為例，研究人員證明該方法可以將來自肺結(jié)核病人的血清，與來自非疾病對照的血清，以及在長時間抗結(jié)核治療后的病例區(qū)分開來。

該方法僅需要膜片鉗記錄裝置（用于納米孔的設(shè)備），以及用于血液樣本采集和臨床分離的常規(guī)臨床實驗室設(shè)備。然而，該方法的樣品前處理仍然需要一些人工操作，從而離實現(xiàn)高通量還有一定距離。該研究團隊目前正在開發(fā)樣品制備和前處理的自動化裝置，以便于進行大型臨床應(yīng)用驗證，并致力于進一步開發(fā)小型化便攜式納米孔傳感器。

總體而言，該種檢測方法具有很好的普適性，可以很容易的應(yīng)用于生物標志物的檢測，從而實現(xiàn)傳染病和慢性疾病的診斷和治療監(jiān)控。

論文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.nantod.2022.101515

審核編輯 ：李倩