循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是腫瘤診斷和監(jiān)測的重要生物標(biāo)志物。然而，因為它們的稀有性，CTCs的檢測仍然具有挑戰(zhàn)性，大多數(shù)的檢測方法都因CTCs在預(yù)富集步驟的丟失和缺乏捕獲不同類型癌細胞的通用抗體而受到限制。目前，CTCs分析通?；趦刹焦ぷ髁鞒?，包括CTCs富集和CTCs檢測。在富集過程中，血液中的CTCs可通過物理性質(zhì)或者生化性質(zhì)被捕獲。細胞的物理性質(zhì)如大小、電荷或彈性可被用于富集CTCs。物理富集方法雖然有效，但往往復(fù)雜，并且不能避免CTCs的丟失。此外，物理富集過程中處理時間長、液體流速高也可能破壞細胞膜的完整性，影響CTCs的下游分析。另一方面，生物化學(xué)方法可以通過靶向腫瘤特異性標(biāo)記物的抗體，例如細胞角蛋白（CK）、上皮細胞粘附分子（EpCAM）、表皮生長因子受體（EGFR）、人表皮生長因子受體-2（HER-2）等，直接分離和檢測CTCs。然而，由于癌細胞的異質(zhì)性，其表面缺乏通用抗原，大多數(shù)基于免疫親和性的方法僅限于特定的癌癥類型或亞型，特別是轉(zhuǎn)移相關(guān)的間質(zhì)型CTCs，很難被常用抗體檢測到。因此，需要迫切開發(fā)出適用于廣譜癌癥類型和亞型的高敏感和特異性的CTCs檢測方法，以適應(yīng)CTCs的臨床應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，香港城市大學(xué)楊夢甦教授課題組聯(lián)合深圳灣實驗室崔淼博士報道了一種包含動態(tài)配體的雙重刺激響應(yīng)單鏈納米鎖（SCNL）聚合物探針，它具有高靈敏度和選擇性，可以與過表達唾液酸（SA）的廣譜腫瘤細胞和CTCs結(jié)合。這種高靈敏度是通過聚合物的單鏈結(jié)構(gòu)和多價功能基團實現(xiàn)的，提高了靶細胞與SCNL之間相互作用的可及性和結(jié)合穩(wěn)定性。腫瘤細胞的靶向高選擇性是通過動態(tài)和雙重刺激響應(yīng)的納米鎖結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的，它可以在同時暴露于過表達的SA和腫瘤酸性微環(huán)境中解鎖并功能化。除了用于CTCs計數(shù)，SCNL方法還可以通過監(jiān)測腫瘤細胞表面SA的表達水平，來實現(xiàn)針對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的評估。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）直接檢測腫瘤細胞和評估癌癥轉(zhuǎn)移的原理示意圖（來源：Biosens. Bioelectron.）

具體來看，這項研究采用動態(tài)結(jié)合策略，設(shè)計了一種具有鎖結(jié)構(gòu)的功能化單鏈納米探針，可在酸性微環(huán)境及過量表達的唾液酸（SA）雙重刺激下動態(tài)打開并與腫瘤細胞相結(jié)合。當(dāng)SCNL遇到腫瘤細胞時，腫瘤細胞周圍的酸性微環(huán)境會刺激嵌段單鏈聚合物（block single chain polymer）與PEG-Glu保護基團之間的預(yù)結(jié)合解離，因此保證了SCNL對腫瘤細胞的檢測特異性。在酸性微環(huán)境下解鎖后，由于SCNL上的苯硼酸官能團（PBA）可與SA同時形成共價鍵和配位鍵，與葡萄糖相比，解鎖后的SCNL（uSCNL）會主要與腫瘤細胞表面過表達的SA分子結(jié)合。此外，保護基團上的PEG片段也有助于減少單核吞噬細胞對SCNL的識別和吸收，從而進一步提高了腫瘤細胞檢測的特異性。綜上，柔軟的單鏈鎖結(jié)構(gòu)有利于SCNL對腫瘤細胞的逐步協(xié)同識別。這種單鏈層面上的分級識別進一步保證了SCNL與CTCs之間的結(jié)合效率和準(zhǔn)確性。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）的制備與表征

（來源：Biosens. Bioelectron.）

本項研究以S，S ‘-雙（ɑ’ɑ‘-二甲基-ɑ“-醋酸丙炔基）三硫代碳酸酯（BDPT）為對稱鏈轉(zhuǎn)移劑（CTA），通過催化可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合反應(yīng)生成ABA型嵌段單鏈聚合物。首先將N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）與丙烯酸-苯基硼酸（acrylate-PBA）共聚形成PBA-大分子CTA（PBA-macro-CTA）作為第一個A嵌段。A嵌段中的共聚丙烯酸酯-PBA促進了單個聚合物鏈上多價PBA官能團的形成，與使用單價PBA修飾方法相比，可以顯著提高單鏈納米凝膠探針與癌細胞的結(jié)合親和性。在第二步B嵌段的聚合中，DMA被引入做為單體并進行聚合，為兩端鏈尾端帶有PBA官能團的A嵌段增加一個柔軟靈活的連接部分。中間polyDMA嵌段的靈活性可以有效地促進功能性PBA基團向癌細胞表面的唾液酸（SA）基團呈遞，最終促成癌細胞與嵌段單鏈聚合物的結(jié)合。以上得到的嵌段單鏈聚合物會繼續(xù)用Cyanine 3（Cy3）熒光基團進行標(biāo)記，并與聚乙二醇修飾的葡萄糖保護基團結(jié)合形成最終的工作探針SCNL。工作探針SCNL的制備過程，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是通過凝膠滲透色譜、紫外吸收光譜、核磁共振（1H NMR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、動態(tài)光散射（DLS）及細胞毒性實驗（MTT）來進行驗證的。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）用于檢測不同類型的腫瘤細胞（來源：Biosens. Bioelectron.）

研究首先使用Cy3標(biāo)記的SCNL來鑒別不同SA表達水平的Hela細胞、HepG-2細胞和A549細胞與正常對照細胞間的信號差異。從共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）的結(jié)果來看，三種癌細胞經(jīng)SCNL探針孵育后，細胞膜上的熒光強度均顯著增加。SCNL孵育后的Hela細胞信號的顯著增加表明，與之前報道的其他基于PBA的探針相比，SCNL探針具有更高的靈敏度和標(biāo)記效率。此外，研究繼續(xù)利用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡技術(shù)證實了SCNL探針對Hela、HepG-2、A549、H1299、H4006、MDA-MB-231和MCF-7細胞系的靶向能力，進一步驗證了SCNL檢測不同類型腫瘤的普遍適用性。

功能化單鏈納米鎖（SCNL）用于檢測模擬樣本和臨床樣品中的CTCs（來源：Biosens. Bioelectron.）

而后，研究進一步將該方法應(yīng)用于3例健康人和5例非小細胞肺癌患者的臨床樣本CTCs檢測中。其中，健康人群的血液樣本中只檢測到極低的CTCs水平（《3 CTCs/mL）。但所有5例患者的樣本均檢測到具有顯著個數(shù)的CTCs，這證實了SCNL探針的樣本高檢出率。為了進一步驗證檢測方法的準(zhǔn)確性，研究將同一個人的血液樣本中基于SCNL的CTCs的檢測結(jié)果與基于EpCAM抗體和CD-45抗體的免疫熒光染色方法的檢測結(jié)果進行了比較?？贵w法和SCNL探針法檢測到的CTCs數(shù)量水平相似，驗證了SCNL探針在CTCs臨床樣本檢測中的準(zhǔn)確性和適用性。

綜上所述，該研究開發(fā)了一種基于SCNL的方法，用于特異性結(jié)合和檢測表面過表達SA分子的癌細胞。通過識別癌細胞周圍的酸性微環(huán)境和癌細胞表面過表達的SA分子，動態(tài)PEG-Glu保護基團和PBA-SA識別機制保證了SCNL探針對癌細胞的特異性靶向作用。其設(shè)計原理和結(jié)合機制使功能化SCNL探針對CTCs具有較高的檢出率。由于SCNL探針在癌細胞表面具有較高的穩(wěn)定性、靈活性和標(biāo)記密度，對于SA表達相對較低的Hela細胞，SCNL方法也表現(xiàn)出較高的敏感性和選擇性。同時，SCNL探針還顯示出對癌細胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險進行評估的潛能來預(yù)測腫瘤的惡性程度。該方法可與微流控技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)高通量和床旁檢測，以滿足精準(zhǔn)醫(yī)療的要求。此外，這項工作還可能激發(fā)新一代單鏈納米探針的開發(fā)，用于如癌癥轉(zhuǎn)移和其他糖蛋白相關(guān)疾病的臨床檢測。