硼親和材料對順式二醇類物質(zhì)具有獨特的親和性，已成為糖蛋白富集的有力手段。然而，硼酸和順式二醇基團之間的親和力比免疫親和相互作用低3-6個數(shù)量級，導致其吸附能力受限。據(jù)報道，具有高度支化結(jié)構(gòu)的硼親和材料能夠?qū)⑵渑c糖蛋白的結(jié)合能力提高2-3個數(shù)量級。八乙烯基多面體低聚倍半硅氧烷（Ov-POSS）具有八個中心點且具有向外輻射的三維籠狀結(jié)構(gòu)，可以聚合形成樹枝狀結(jié)構(gòu)聚合物，高密度活性位點均勻分布于聚合物骨架表面，從而與目標物官能團產(chǎn)生強結(jié)合作用。

近期，天津醫(yī)科大學劉照勝、黃艷萍教授課題組報道了一種利用樹枝狀八乙烯基多面體低聚倍半硅氧烷（Ov-POSS）提高硼親和位點可及性來特異性富集糖肽和糖蛋白的新策略，并將制備的硼親和整體柱用作微流控平臺的一部分，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的在線分級、變性、酶解以及糖肽、泛素化肽的富集。相關(guān)成果以“Boronate Avidity Assisted by Dendrimer-like Polyhedral OligomericSilsesquioxanes for a Microfluidic Platform for Selective Enrichment ofUbiquitination and Glycosylation”為題發(fā)表在國際化學權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。

首先，研究人員提出以O(shè)v-POSS為核心形成樹枝狀聚合物的交聯(lián)策略。將3-（丙烯酰胺基）苯基硼酸（AAPBA）作為功能單體，制備出具有高硼親和位點密度的聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱（圖1）。

圖1 基于Ov-POSS的樹枝狀硼親和整體柱和傳統(tǒng)硼親和整體柱對比示意圖

隨后，研究人員比較了Ov-POSS交聯(lián)和不含Ov-POSS整體柱的吸附能力，結(jié)果表明聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱的吸附容量是常規(guī)非Ov-POSS交聯(lián)整體柱的27倍（圖2a）。通過糖蛋白（HRP、Trf）和腺苷的結(jié)合強度測定發(fā)現(xiàn)，與Trf（4個糖基化位點）和腺苷（1個糖基）相比，該樹枝狀硼親和材料對糖基數(shù)量多的HRP（9個糖基化位點）親和能力分別提高3個數(shù)量級和4個數(shù)量級（圖2b?d）。證明樹枝狀硼親和材料更有利于硼酸官能團協(xié)同結(jié)合多糖修飾的糖蛋白。

圖2 （a）聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱和不含Ov-POSS整體柱對HRP的吸附等溫線；聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱與（b）HRP、（c）Trf和（d）腺苷結(jié)合的Scatchard圖

接下來，研究人員用SDS-PAGE和MALDI-TOF MS光譜研究了對糖蛋白和糖肽的特異性。如圖3a所示，BSA和HRP混合液經(jīng)過聚（AAPBA-co-Ov-POSS-co-EDMA）整體柱處理后，非糖蛋白BSA條帶消失，表明該材料對糖蛋白優(yōu)異的選擇性。此外，HRP酶解液富集實驗中，未經(jīng)富集的酶解液中僅檢測到1種糖肽（圖3b），而經(jīng)過富集后，以更高的信噪比檢測到23種糖肽（圖3c）。

圖3 糖蛋白和糖肽的特異性評估：（a）SDS-PAGE分析：泳道1：標準分子量；泳道2：蛋白質(zhì)混合物；泳道3：上樣流出液；泳道4：淋洗液；泳道5：洗脫液；（b）未富集和（c）富集后胰蛋白酶HRP消化液

最后，將該樹枝狀硼親和整體柱用于構(gòu)建多功能微流控芯片平臺，在線處理小鼠肝臟蛋白質(zhì)，該平臺集成了蛋白質(zhì)分級、變性、酶水解和糖肽和泛素肽富集五個功能區(qū)（圖4）。與離線方法相比，蛋白質(zhì)樣品預處理時間減少近一半，且新鑒定到86.7%的糖肽、75%的糖蛋白、100%的泛素肽和95.8%的泛素化蛋白。

圖4 微流控芯片集成平臺的示意圖

研究人員首次證明了Ov-POSS輔助硼酸單體形成樹枝狀結(jié)構(gòu)的策略，能夠顯著提高硼親和材料的親和力和位點可及性。最后，將該硼親和整體柱應用于構(gòu)建微流控芯片平臺，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)樣品的在線預處理，以及糖肽和泛素肽的同時鑒定。開發(fā)的微流控平臺為蛋白質(zhì)組學的自動化、高效、高通量分析提供一種有前途的工具。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04005

審核編輯 ：李倩