大腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用異常會導(dǎo)致神經(jīng)疾病，如多發(fā)性硬化癥（MS）及其自身免疫性腦脊髓炎（EAE）。表征星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用是重要的治療靶點(diǎn)之一。然而，目前的方法并不能直接反映細(xì)胞互作與分子水平變化的相關(guān)性，并且難以檢測由表面或分泌因子介導(dǎo)瞬時的細(xì)胞互作，因此檢測方法亟需改進(jìn)。

正向遺傳篩選平臺，例如基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的平臺，雖然是鑒定基因的強(qiáng)大工具，但無法進(jìn)行高通量共培養(yǎng)和受擾動單細(xì)胞的篩選，限制了它們在研究細(xì)胞互作中的應(yīng)用。用于研究細(xì)胞互作的正向遺傳篩選平臺需要能夠在受控微環(huán)境中建立由表面或分泌因子介導(dǎo)的細(xì)胞互作，同時需要能夠檢測由這些互作產(chǎn)生的現(xiàn)象，并確定這些變化是否由特定CRISPR-Cas9誘導(dǎo)。

近期，來自哈佛醫(yī)學(xué)院的Francisco J. Quintana團(tuán)隊在Science上發(fā)表了題為“Droplet-based forward genetic screening of astrocyte–microglia cross-talk”的文章，展示了一種基于液滴微流控技術(shù)的高通量平臺“SPEAC-seq”，可以用于細(xì)胞互作的正向遺傳篩選。

研究人員首先將兩種細(xì)胞用微流體進(jìn)行共封包形成油包液滴并在試管中共培養(yǎng)，接著經(jīng)三色光學(xué)器件和介電泳微流控分選儀篩選出成功封包細(xì)胞對的液滴，用于后續(xù)細(xì)胞互作的研究。隨后使用具有細(xì)胞滲透性的熒光染料進(jìn)行多重標(biāo)記，用于加樣和檢測液滴中的細(xì)胞對。圖1F顯示了優(yōu)化液滴分選參數(shù)后，分離出的報告基因激活的細(xì)胞對，初步檢測到與激活的巨噬細(xì)胞配對的NF-kB標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，EGFP表達(dá)的上調(diào)。以上說明研究人員成功建立了基于油包液滴的共培養(yǎng)體系。

圖1 基于液滴微流控技術(shù)的細(xì)胞互作篩選平臺示意圖

接下來，研究人員將基于液滴的共培養(yǎng)系統(tǒng)與CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)相結(jié)合，建立了SPEAC-seq平臺，用于檢測細(xì)胞互作的正向遺傳篩選，并將其應(yīng)用于鑒定參與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-kB激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。研究人員使用全基因組CRISPR-Cas9文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并使用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞，并將其與NF-kB報告的星形膠質(zhì)細(xì)胞共封裝24小時，然后分選含有由小膠質(zhì)細(xì)胞和EGFP+星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的活細(xì)胞對的液滴。

通過基因組DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和深度測序從少量分選的液滴中分選出了穩(wěn)定摻入小膠質(zhì)細(xì)胞基因組DNA的單向?qū)NA（sgRNA） 序列，用于分析針小膠質(zhì)細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-kB因子的sgRNA，最終得到了1061個候選分子的列表。對正液滴分?jǐn)?shù)的分析發(fā)現(xiàn)了已知的NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)因子，包括異生物質(zhì)代謝、核受體激活和NRF2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，分選到的液滴數(shù)量和檢測到的引導(dǎo)RNA序列的數(shù)量高度一致。圖2G顯示了用生信分析發(fā)現(xiàn)了SPEAC-seq檢測到的抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-kB激活的途徑。

圖2 SPEAC-seq鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎反應(yīng)的因子

為了進(jìn)一步評估SPEAC-seq發(fā)現(xiàn)的每個候選通路在炎癥環(huán)境下的調(diào)節(jié)作用，研究人員應(yīng)用了一種細(xì)胞類型特異性的體內(nèi)Perturb-seq方法。研究人員設(shè)計了慢病毒載體共表達(dá)四種sgRNA，這些sgRNA靶向星膠特異的Cas9開放閱讀框中的barcode，分別對應(yīng)Egfr、Gfra2、Lag3、Oprl1這四種星膠受體。小鼠自身免疫性腦脊髓炎（EAE）造模后，用流式分選出EGFP陽性的星膠膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行SPEAC-seq檢測。

結(jié)果顯示，表達(dá)Egfr、Gfra2、Lag3或Oprl1的sgRNA的星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-kB轉(zhuǎn)錄激活增加，Egfr靶向?qū)е翴L-1b/TNFa信號通路的激活最強(qiáng)，從而促進(jìn)NF-kB轉(zhuǎn)導(dǎo)的與EAE和MS相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。雙調(diào)蛋白可在中風(fēng)期間導(dǎo)致外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，這表明它是在對創(chuàng)傷和/或炎癥的反應(yīng)中被誘導(dǎo)產(chǎn)生的。

確實(shí)，EAE誘導(dǎo)后17天檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞中Areg表達(dá)增加。與SPEAC-seq數(shù)據(jù)一致，Egfr在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平高于在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平。以上結(jié)果說明了在EAE模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的AREG通過星膠EGFR受體抑制星膠的促炎反應(yīng)。

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的AREG抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎反應(yīng)

最后，研究人員想探索EAE期間，什么病理因素可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞Areg的表達(dá)。已有研究表明IL-33是EAE的抑制劑，Areg表達(dá)的誘導(dǎo)劑。IL-33是組織損傷后細(xì)胞釋放的一種警報素。為了確定IL-33是否調(diào)節(jié)AREG介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞互作，研究人員首先重新分析了RABID-seq數(shù)據(jù)集，并確定了在EAE峰值期間與Areg+和Areg-小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，提示了EAE期間星膠分泌的IL-33信號是調(diào)節(jié)Areg+小膠質(zhì)細(xì)胞的上游因子。為了驗(yàn)證這種RABID-seq預(yù)測，研究人員在體外用重組IL-33刺激原代小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞Areg/AREG表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)表明星膠產(chǎn)生的IL-33誘導(dǎo)的小膠表達(dá)Areg，然后抑制星膠的促炎作用這樣的一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

圖4 IL-33-ST2信號通路控制星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞互作

此外，研究人員還在MS患者病變中檢測到IL33+GFAP+細(xì)胞和AREG+小膠質(zhì)細(xì)胞增加，以及小膠質(zhì)細(xì)胞ST2（IL-33 受體）介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號增加，以上結(jié)果表明了星膠來源的IL-33可促進(jìn)ST2+小膠細(xì)胞中AREG的表達(dá)。

圖5 免疫染色檢測MS患者CNS樣本中的IL33+星形膠質(zhì)細(xì)胞

綜上所述，該研究基于液滴微流控技術(shù)建立了可以用于檢測細(xì)胞互作的SPEAC-seq平臺，它能夠進(jìn)行正向遺傳篩選以識別細(xì)胞通訊機(jī)制，并確定了一個由小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用驅(qū)動的調(diào)節(jié)負(fù)反饋回路，該相互作用由雙調(diào)蛋白和IL33-ST2信號介導(dǎo)，抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-kB驅(qū)動的炎癥反應(yīng)，可能是導(dǎo)致EAE和MS的原因之一。SPEAC-seq可以與表觀基因組或轉(zhuǎn)錄組的全基因組分析相結(jié)合，以研究它們通過細(xì)胞間相互作用的調(diào)控，或與抗體或小分子barcode文庫，用于識別細(xì)胞間通訊的治療靶點(diǎn)。

審核編輯：劉清