常見(jiàn)的拉曼光譜系統(tǒng)主要分為四個(gè)組成部分：

1. 激發(fā)光源（激光）

2. 樣品激發(fā)與信號(hào)收集部分

3. 波長(zhǎng)選擇部分

4. 探測(cè)器

根據(jù)波長(zhǎng)選擇部分的不同，拉曼光譜技術(shù)可以分為兩個(gè)類(lèi)型[圖3]：1.基于色散的拉曼光譜系統(tǒng)。2.基于傅里葉變換的拉曼光譜系統(tǒng)（FT-Raman）[1]。對(duì)于前者，探測(cè)的拉曼信號(hào)通過(guò)光柵等分光器件進(jìn)行分光，然后使用ccd，二極管陣列同時(shí)探測(cè)不同波長(zhǎng)的拉曼信號(hào)。對(duì)于后者，探測(cè)器使用的是PMT，APD等點(diǎn)探測(cè)器，得到的原始信號(hào)是拉曼信號(hào)經(jīng)過(guò)邁克爾遜干涉儀的信號(hào)，拉曼光譜是通過(guò)對(duì)干涉信號(hào)的傅里葉變換得到的。因?yàn)镕T-Raman測(cè)量光譜時(shí)間很長(zhǎng)，需要~30分鐘。因而現(xiàn)在主流的拉曼設(shè)備是基于色散的拉曼光譜系統(tǒng)。

圖 1 拉曼光譜系統(tǒng)的分類(lèi)與基本組成部分（a）色散型拉曼系統(tǒng)（b）傅里葉變換拉曼系統(tǒng)

下面將描述色散類(lèi)拉曼光譜系統(tǒng)的各個(gè)組成部分的技術(shù)要求。

#激發(fā)光源

由于拉曼信號(hào)比較微弱，因此為了得到可以探測(cè)的拉曼光譜，激發(fā)光源需要使用激光器。在20年前，氬氣和氪氣離子激光器是主要使用的激發(fā)光源。近些年來(lái)，隨著半導(dǎo)體激光器技術(shù)的發(fā)展，一些工作波長(zhǎng)是近紅外的半導(dǎo)體激光器也成為了主流。根據(jù)激發(fā)波長(zhǎng)的不同，激發(fā)光源可以分為三個(gè)類(lèi)型[1]，他們都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。

1. 紫外光源，波長(zhǎng)是244 nm，257 nm，325 nm，364 nm

2. 可見(jiàn)光光源，457 nm，488 nm，514 nm， 532 nm，633 nm，660 nm

3. 近紅外光源，785 nm，830 nm，980 nm，1064 nm。

紫外光的光源通常是使用氬離子激光器。在紫外光激發(fā)的條件下，分子可以到電子激發(fā)態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)共振拉曼激發(fā)，這可以顯著的提高拉曼的信號(hào)強(qiáng)度。此外，紫外激發(fā)時(shí)（＜270nm），拉曼光譜與熒光光譜在不同的波長(zhǎng)范圍，因此紫外拉曼可以消除熒光的影響。紫外激發(fā)可以與蛋白質(zhì)，DNA，RNA等生物樣品產(chǎn)生特定性的拉曼增強(qiáng)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本特定結(jié)構(gòu)的分析，而是用可見(jiàn)光是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的[2]。此外，由于紫外光在半導(dǎo)體的穿透深度一般是幾個(gè)納米，因而紫外拉曼可以用來(lái)對(duì)樣品表面的薄層（常見(jiàn)于新型硅基材料SOI材料)。

但是因?yàn)樽贤夤馐床灰?jiàn)，并且紫外激光器相對(duì)更大型、更復(fù)雜，也更加昂貴，目前紫外拉曼實(shí)驗(yàn)依然屬于高端技術(shù)，需要高水平專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作。此外由于紫外光子的能量更高，在紫外激光照射下樣品更易于燒壞或者降解，生物樣本也更容易產(chǎn)生變異[3]。

可見(jiàn)光激光器通常為二極管激光器，532nm激光器通常為半導(dǎo)體激光器泵浦的固態(tài)激光器（DPSS）激光器。相比于紫外光激發(fā)的拉曼系統(tǒng)，可見(jiàn)光拉曼系統(tǒng)的激發(fā)光源體積小巧，價(jià)格便宜。對(duì)于鏡片、探測(cè)器等也沒(méi)有特別要求。對(duì)樣本也不容易產(chǎn)生損傷。此外，雖然相比紫外拉曼信號(hào)較弱，但是相對(duì)于近紅外激發(fā)，由于信號(hào)波長(zhǎng)較短，所以可見(jiàn)光拉曼信號(hào)強(qiáng)度仍然較高[1]。

但是在可見(jiàn)光范圍，生物樣本、有機(jī)樣本會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，因此可見(jiàn)光激光器通常用于測(cè)試無(wú)機(jī)物樣本。對(duì)于有機(jī)物與生物樣本，一般使用近紅外激光器激發(fā)。

近紅外激光器通常為二極管激光器，其中1064nm激光器通常為Nd:YAG激光器。相比于基于可見(jiàn)光的拉曼系統(tǒng)，近紅外激光器激發(fā)樣本產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)小很多[圖4][4]。此外近紅外激光的穿透深度比可見(jiàn)光大，因此近紅外拉曼系統(tǒng)經(jīng)常用于生物樣本與有機(jī)樣本的研究。

圖 2 不同激發(fā)光波長(zhǎng)下熒光背景對(duì)比，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，熒光背景越小

不過(guò)因?yàn)槔盘?hào)強(qiáng)度與拉曼散射的波長(zhǎng)的四次方成反比，因而使用近紅外激發(fā)時(shí)，拉曼信號(hào)相比使用可見(jiàn)光與紫外光激發(fā)的時(shí)候，會(huì)弱很多。此外拉曼信號(hào)波長(zhǎng)達(dá)到了1000nm，在這個(gè)區(qū)間，普通的ccd信噪比較低，因而需要使用特別的CCD，比如深度耗盡類(lèi)CCD。

#樣品激發(fā)與信號(hào)收集部分

拉曼系統(tǒng)中，激發(fā)光一般是使用光纖傳輸或者是使用物鏡/透鏡匯聚到樣本之上，然后再使用光纖或者透鏡收集產(chǎn)生的拉曼信號(hào)，然后傳輸?shù)焦庾V儀中分光被探測(cè)器探測(cè)。具體不同的樣品激發(fā)與收集構(gòu)型可以參見(jiàn)第四章。

#波長(zhǎng)選擇部分

色散類(lèi)拉曼系統(tǒng)，也主要分為兩種類(lèi)型，一種是使用單色儀+PMT,另外一種是使用多色儀+CCD[3]。然而單色儀+PMT系統(tǒng)需要掃描光柵來(lái)探測(cè)不同波長(zhǎng)的拉曼信號(hào)，因而探測(cè)一個(gè)完整的拉曼光譜需要較長(zhǎng)的時(shí)間。而隨著半導(dǎo)體技術(shù)的發(fā)展，CCD現(xiàn)在也具有較高的靈敏度和信噪比，因此使用多色儀+CCD成為了主流的拉曼系統(tǒng)類(lèi)型[圖5]。由于常見(jiàn)的拉曼光譜峰寬度在~20cm-1[5]，因而要求多色光譜儀分辨率至少好于10cm-1。此外拉曼光譜一般分布在500-1800cm-1，這個(gè)區(qū)域一般被稱(chēng)為指紋區(qū)域，因此要求設(shè)計(jì)光柵使CCD可以探測(cè)這個(gè)區(qū)域的信號(hào)。

圖 3 基于多色儀與CCD的探測(cè)系統(tǒng)

#探測(cè)器

由于拉曼信號(hào)十分微弱，因此對(duì)于CCD的靈敏度有較高的要求，因而通常使用背照式的CCD提高量子效率。而為了能探測(cè)785nm激光激發(fā)的信號(hào)，需要探測(cè)器在1000nm附近有較好的相應(yīng)，因此需要使用深度耗盡類(lèi)CCD[圖6]。此外，為了降低暗噪聲的影響，通常需要對(duì)ccd進(jìn)行降溫。

圖 4 不同類(lèi)型CCD的量子效率曲線(xiàn)。背照式CCD顯著的提高了量子效率。深度耗盡類(lèi)CCD提高了近紅外的響應(yīng)

#拉曼信號(hào)處理方式

拉曼光譜包括了許多拉曼峰，每個(gè)拉曼峰的主要信息包括峰值的位置，寬度，強(qiáng)度。為了能夠從拉曼光譜中獲取更多的信息，需要對(duì)拉曼光譜進(jìn)行進(jìn)一步的處理。首先是先對(duì)拉曼光譜進(jìn)行去除熒光，光譜儀強(qiáng)度響應(yīng)矯正，波長(zhǎng)標(biāo)定等，得到波長(zhǎng)，峰值均為準(zhǔn)確的拉曼光譜。然后對(duì)于拉曼光譜可以進(jìn)行以下三種處理[圖7]

圖 5 拉曼光譜的三種處理方式

1. 直接觀察拉曼光譜峰高度，光譜位置的變化，分別可以得到分子濃度，分子結(jié)構(gòu)的變化。比較適合進(jìn)行定性的分析，比如研究不同疾病的生物組織的組分變化[6]。

2. 首先采集含有足夠大樣本的光譜庫(kù)，然后在獲取新的樣本信號(hào)時(shí)可以進(jìn)行分類(lèi)算法，判斷出未知樣本屬于光譜庫(kù)里的哪個(gè)樣本。從而可以實(shí)現(xiàn)樣本識(shí)別，疾病診斷等等。常見(jiàn)的分類(lèi)算法包括了PCA-LDA，PLS-DA等[7]。

3. 由于拉曼信號(hào)強(qiáng)度與分子的濃度呈正比。因此混合物的拉曼光譜可以認(rèn)為是各個(gè)組分的拉曼光譜以其濃度為權(quán)重的疊加。因而使用線(xiàn)性分解，MCR-ALS等算法可以得到混合物中各個(gè)組分的濃度，這種方法常用于顯微拉曼系統(tǒng)中[8]。

審核編輯：湯梓紅