外泌體因其具有豐富的生物信息和高穩(wěn)定性，被認(rèn)為是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）診斷的新型生物標(biāo)志物。然而，對(duì)于具有特異性表面受體的外泌體的準(zhǔn)確檢測(cè)限制了其臨床應(yīng)用。

近期，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院杜魯濤教授課題組在Small期刊上發(fā)表了題為“Construction of Exosome SORL1 Detection Platform Based on 3D Porous Microfluidic Chip and its Application in Early Diagnosis of Colorectal Cancer”的文章，構(gòu)建了3D多孔海綿微流控芯片上的外泌體富集平臺(tái)，該芯片的外泌體捕獲效率約為90%。此外，研究人員通過(guò)深度質(zhì)譜分析后進(jìn)行多級(jí)表達(dá)篩選，揭示了CRC特異性外泌體膜蛋白（SORL1），并進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種基于特定量子點(diǎn)標(biāo)記的SORL1檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)64張熒光圖像進(jìn)行特征提取，建立了集成分類(lèi)系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)的曲線下面積（AUC）為0.99，明顯高于使用傳統(tǒng)生物標(biāo)志物。上述系統(tǒng)在處理早期、進(jìn)展期和CEA陰性結(jié)直腸癌患者時(shí)表現(xiàn)出類(lèi)似的診斷性能。

為克服近表面流體動(dòng)力學(xué)阻力，提高表面體積比，并增強(qiáng)微通道內(nèi)的傳質(zhì)，研究人員設(shè)計(jì)并構(gòu)建了新型多孔海綿芯片。該平臺(tái)由簡(jiǎn)單制備而成的聚二甲基硅氧烷（PDMS）預(yù)聚體、固化劑、研磨NaCl微粒生成硬模板。通過(guò)調(diào)節(jié)模板與PDMS預(yù)聚體的混合比例和NaCl粉末的直徑，從而改變微流控芯片中PDMS海綿的多孔結(jié)構(gòu)（圖1A）。針對(duì)CRC患者，通過(guò)質(zhì)譜蛋白組學(xué)分析篩選到一個(gè)新的外泌體表面蛋白SORL1，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting，WB）和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。接著，利用構(gòu)建的多孔海綿芯片和硅量子點(diǎn)（Si-QD）共軛捕獲抗體檢測(cè)CRC患者血清中外泌體SORL1的表達(dá)（圖1B）。最后，將獲得的熒光圖像使用基于AI的集成分類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)行分析和量化，該系統(tǒng)可以高效準(zhǔn)確地區(qū)分CRC患者和非CRC人群（圖1C）。

圖1 3D多孔海綿芯片的構(gòu)建及外泌體的分析

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)CRC來(lái)源外泌體的高靈敏度檢測(cè)，研究人員首先使用球磨機(jī)研磨NaCl顆粒形成均勻的粉末。如圖2A所示，未處理的NaCl平均粒徑在粉碎后由176μm ± 35μm減小到3.35μm ± 0.87 μm，說(shuō)明粉碎方法可以有效降低NaCl平均粒徑。多孔海綿芯片的實(shí)物圖和渲染圖如圖2B所示。芯片（左上面板）中心的白色區(qū)域是多孔PDMS海綿結(jié)構(gòu)，在相鄰的多孔結(jié)構(gòu)之間具有凹槽，以破壞層流。多孔PDMS結(jié)構(gòu)的表面和斷面掃描電子顯微鏡（SEM）圖像也顯示了具有相互連通的孔洞的多孔形貌。該研究利用PDMS可以非特異性地大量吸附蛋白質(zhì)的原理，將抗體高效地固定在芯片內(nèi)部的多孔PDMS結(jié)構(gòu)上。使用CD9抗體進(jìn)行固定以捕獲外泌體，并選擇兩種抗體固定方法：分別在37℃孵育2 h和4℃孵育過(guò)夜。為了探究最佳的抗體固定方法，使用熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行熒光成像。以FITC二抗的熒光強(qiáng)度用來(lái)評(píng)價(jià)一抗固定效果。對(duì)于BSA和PBS孵育的兩組芯片，非特異性熒光吸附較弱，兩組芯片的熒光強(qiáng)度均遠(yuǎn)低于CD9抗體孵育組（圖2C）。37℃孵育2 h后的抗體固定量是4℃孵育過(guò)夜的4.797倍，表明37°C孵育2 h是抗體固定的最佳條件。

隨后，研究人員通過(guò)超速離心法從SW1116細(xì)胞的培養(yǎng)上清中獲得純化的結(jié)腸癌外泌體。采用透射電子顯微鏡（TEM）、Western blotting和納米顆粒跟蹤分析（NTA）3種應(yīng)用最廣泛的外泌體分析方法對(duì)分離的外泌體進(jìn)行性質(zhì)表征。圖2D顯示了標(biāo)準(zhǔn)的外泌體形態(tài)，包括圓形或橢球形。采用NTA分析外泌體濃度和平均直徑。粒徑為103.1 nm，峰濃度為7.7 × 10?，與文獻(xiàn)報(bào)道一致（圖2E）。利用Western blotting鑒定出癌細(xì)胞和外泌體膜靶蛋白CD9、CD63和TSG101（圖2F）。隨著樣品的持續(xù)進(jìn)樣，芯片的實(shí)時(shí)熒光捕獲效率逐漸降低。20 μL時(shí)熒光強(qiáng)度（ΔFL）最高為97.45% ± 2.29%，100 μL時(shí)ΔFL最低為74.45% ± 8.8%，ΔFL的平均熒光效率為85.25% ± 5.51%（圖2G）。多孔海綿芯片的NTA捕獲效率為80.12% ± 3.45%，而超速離心僅為15.5% ± 1.70%（圖2H）。熒光圖像進(jìn)一步揭示了外泌體具有較高的捕獲效率（圖2I）。NTA和熒光分析得到的結(jié)果一致，證明了多孔海綿芯片分離和捕獲外泌體的高效性。

圖2 外泌體和3D多孔海綿芯片的表征 接著，研究人員初步選取8例健康人（HCs）和8例CRC患者的血清樣本，對(duì)收集到的血清外泌體進(jìn)行無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析。與HCs相比，CRC患者中共鑒定出367個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白136個(gè)，下調(diào)蛋白231個(gè)，包括FTH1、RPS8、CFH、PIGR、PSMA3和CCT8（圖3A）。在CRC和正常樣本中分別有25個(gè)蛋白和62個(gè)蛋白特異性表達(dá)。

為了驗(yàn)證篩選出的分子是否位于外泌體膜表面，研究人員使用SW620細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行流式檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CRC樣本中SORL1和PSMA3的熒光強(qiáng)度較高，而CCT8、PIGR和CAT表達(dá)在基礎(chǔ)水平，表明SORL1和PSMA3定位于外泌體膜表面（圖3B）。接下來(lái)，通過(guò)Western blotting分析測(cè)定細(xì)胞上清和血清樣本外泌體中SORL1和PSMA3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在CRC細(xì)胞培養(yǎng)上清中可以穩(wěn)定檢測(cè)到SORL1和PSMA3（圖3C）。此外，與HCs相比，SORL1在CRC患者血清中表現(xiàn)出更高的表達(dá)，而PSMA3的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D）。通過(guò)對(duì)27例CRC患者和27例HCs血清中外泌體SORL1的定量檢測(cè)，研究人員證實(shí)了CRC患者血清中SORL1的水平顯著高于HCs，表明外泌體SORL1在區(qū)分結(jié)直腸癌患者和非結(jié)直腸癌人群中的潛在診斷價(jià)值（圖3E）。

圖3 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)外泌體蛋白的分析

為了利用3D微流控芯片有效定量SORL1的表達(dá)，研究人員制備了Si-QD偶聯(lián)的SORL1抗體（Si-QD-SORL1）。TEM結(jié)果表明Si-QD和SORL1抗體融合，成功合成了Si-QD-SORL1復(fù)合物（圖4A）。UV-vis光譜掃描結(jié)果證明Si-QD在357 nm處有明顯的吸收峰，加入SORL1抗體形成Si-QD-SORL1復(fù)合物后，吸收峰明顯減弱（圖4B）。將3D多孔芯片與Si-QD-SORL1結(jié)合后，在室溫下放置10min、30min、50min、70min和90 min后評(píng)估熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在所考察的時(shí)間范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，表明Si-QD-SORL1復(fù)合物具有較高的穩(wěn)定性（圖4C）。為了確認(rèn)注入芯片的樣品熒光強(qiáng)度是飽和且穩(wěn)定的，研究人員測(cè)試了多孔芯片組合的最佳Si-QD-SORL1的體積和濃度。根據(jù)圖4D所示，芯片從左到右有3個(gè)捕獲區(qū)域，捕獲區(qū)域的熒光分布均勻穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確反映外泌體SORL1的整體表達(dá)情況（圖4E）。此外，研究人員對(duì)外泌體進(jìn)行PKH67-green染色，觀察到Si-QD-SORL1（紅色信號(hào)）與CD9結(jié)合的外泌體共定位（圖4F）。這證實(shí)了熒光信號(hào)是通過(guò)兩步免疫反應(yīng)檢測(cè)通道中的量子點(diǎn)產(chǎn)生的。

圖4 Si-QD-SORL1及外泌體檢測(cè)系統(tǒng)的表征

為了更好地理解和準(zhǔn)確判讀熒光成像結(jié)果，研究人員通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）高分辨率熒光篩選，開(kāi)發(fā)、訓(xùn)練和優(yōu)化了圖像檢測(cè)模塊。首先，為了提高集成系統(tǒng)的解譯效果，系統(tǒng)將影像劃分為64個(gè)圖斑，并基于亮度、方差和均值3個(gè)特征獲取信息（圖5A）。接下來(lái)，研究人員招募了一個(gè)獨(dú)立、匹配和隨機(jī)分配的人群隊(duì)列，包括106名CRC和100名HC，并將其分為訓(xùn)練和測(cè)試階段。在訓(xùn)練階段采用隨機(jī)森林分析建立臨床判別模型，在測(cè)試階段采用交叉驗(yàn)證。為了驗(yàn)證外泌體SORL1區(qū)分CRC患者和HC的能力，研究人員隨機(jī)選取了27例CRC患者和25例HC患者作為訓(xùn)練集，其余樣本在測(cè)試集中進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，與健康人相比，SORL1在CRC患者樣本中顯著上調(diào)（圖5B）。91.14%的CRC患者（79人中有72人）和100%的HCs被正確診斷（圖5C），同時(shí)具有達(dá)到0.99的工作特征曲線下面積（AUC）（圖5D）。同時(shí)，研究人員也考察了外泌體SORL1在其他幾個(gè)特定人群。他們檢測(cè)了該方法對(duì)80例早期CRC患者（期和Ⅱ期）的診斷性能。結(jié)果表明，早期CRC患者和HCs的樣本可以被有效區(qū)分（圖5E），其診斷靈敏度達(dá)到97.50%，AUC為0.99（圖5F、5G），具有較好的診斷準(zhǔn)確性。

目前對(duì)于50歲以下的低中危人群的CRC篩查尚未達(dá)成（young CRC patients，yCRC)。在yCRC人群中，該方法的結(jié)果清楚地揭示了外泌體SORL1可以區(qū)分yCRC患者和HCs，診斷敏感性和特異性均達(dá)到100%（圖5H）。但對(duì)于yCRC的診斷結(jié)果可能需要進(jìn)一步的研究，因?yàn)樵撗芯績(jī)H有12例yCRC患者。在該研究中，研究人員同時(shí)增加了35個(gè)腫瘤樣本，包括12個(gè)胃癌（gastric cancer，GC）、12個(gè)肺癌（lung cancer，LC）和11個(gè)胰腺癌（pancreatic cancer，PANC）樣本，以驗(yàn)證SORL1是否在CRC中特異性表達(dá)。利用上述35例腫瘤樣本，隨機(jī)選取35例健康對(duì)照者，共形成70例樣本，構(gòu)成非CRC對(duì)照組。結(jié)果表明，SORL1可以從非CRC癌癥患者中診斷CRC患者，靈敏度和特異度分別達(dá)到93.67%和96.15%（圖5I）。

圖5 基于AI分類(lèi)的外泌體SORL1的診斷性能

單一標(biāo)志物CEA檢測(cè)常用于血液學(xué)CRC篩查。結(jié)果顯示，CEA的診斷敏感性為47.17%，在106例CRC患者中僅有50例被正確診斷（圖6A、6B）。而超過(guò)一半的早期CRC病例CEA陰性，表明其在早期CRC患者中的診斷能力較差。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在56例CEA陰性患者中，52例患者被本研究提出的方法正確診斷（圖6C），診斷AUC為0.99（圖6D）。

該研究的方法的潛在應(yīng)用在兩個(gè)病例中得到了肯定，這兩個(gè)病例通過(guò)該研究發(fā)展的方法得以正確診斷，而其被CEA、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）和結(jié)腸鏡檢查遺漏了（圖6E）。一號(hào)病人因排便不規(guī)律而入院。結(jié)腸鏡檢查顯示無(wú)明顯惡性特征，診斷為良性息肉（圖6F）。然而，術(shù)后病理報(bào)告證實(shí)了高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（圖6F）。第二例患者也出現(xiàn)了類(lèi)似的情況，該患者使用基于SORL1的微流控芯片方法診斷為CRC，病理證實(shí)為原位I期CRC，但CEA和EpCAM未發(fā)現(xiàn)（圖6E、6F）。這些結(jié)果有力地證明了外泌體SORL1在檢測(cè)微小腫瘤和早期CRC方面的優(yōu)勢(shì)。

圖6 通過(guò)SORL1等方法診斷CRC

綜上所述，該研究通過(guò)在微流控芯片上構(gòu)建3D多孔海綿結(jié)構(gòu)，將其與新發(fā)現(xiàn)的CRC分子標(biāo)記物SORL1、量子點(diǎn)檢測(cè)方法和機(jī)器學(xué)習(xí)智能分析系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種新型特異高效的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。該平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體在芯片表面的高度富集，便于快速捕獲和定量檢測(cè)。新建立的智能圖像判別系統(tǒng)能夠高效地實(shí)現(xiàn)CRC的早期診斷，為CRC的早期檢測(cè)提供了新方法和新途徑。

審核編輯：劉清