納米孔作為膜通道，能夠介導信息交換，促進分子識別，然而，目前用于連接納米孔、進行信號讀出的電子設備信息傳輸效率較低，這成為了繼續(xù)開發(fā)高性能生物電子器件的主要障礙之一。

來自加州大學圣克魯斯分校的Marco Rolandi和來自麻省理工學院的Ashwin Gopinath團隊將DNA納米孔與生物質(zhì)子電極相結(jié)合，以創(chuàng)建可編程的、模塊化的、高效的人工離子通道接口。研究表明，膽固醇修飾的DNA納米孔具有顯著的親和力，能夠跨越平面生物質(zhì)子電極表面形成的脂雙層，介導質(zhì)子在脂雙層上的傳輸，識別生物分子信號。該工作以“DNA nanopores as artificial membrane channels forbioprotonics”為題，發(fā)表在Nature Communication期刊上。

首先，研究人員將合成的基于自組裝DNA納米孔的離子通道與H?選擇性鈀（Pd）電極結(jié)合在一起，創(chuàng)造了一種生物質(zhì)子器件，該器件可以記錄和調(diào)節(jié)穿過雙層膜的H?電流（圖1）。如圖1所示，DNA納米孔跨越脂質(zhì)雙層膜，該膜位于與微流控結(jié)構(gòu)集成的Pd觸點頂部。

由于極性變化，Pd觸點和溶液中的Ag/AgCl參比電極之間的電壓（VH?）會在Pd觸點和溶液之間產(chǎn)生H?的流動，H?的流動會誘導PdHx的電化學形成（或溶解），從而在電子電路中產(chǎn)生可測量的電流（IH?），研究人員使用該方法來測量由于離子通道插入和活性變化而導致的膜電導變化。

接著，為了創(chuàng)建仿生離子通道，使H?能夠在脂雙層上轉(zhuǎn)移，研究人員通過自下而上的合理設計，用等摩爾量的13條短ssDNA鏈自組裝成6個相互連接的螺旋束（6HB），形成了一個14 nm長的具有中空管腔的納米桶狀結(jié)構(gòu)。然后，研究人員用四乙二醇-膽固醇（TEG-Chol）將DNA納米孔功能化，為親水性DNA納米孔插入到脂雙層的疏水環(huán)境提供錨點，進一步表征確定了納米孔的尺寸、穩(wěn)定性及孔徑。

圖1 生物質(zhì)子器件原理圖

為了驗證DNA納米孔離子通道確實是H?導體，研究人員測量了DNA生物電子器件中IH?對VH?的依賴性。首先，研究人員驗證了裸Pd接觸在溶液界面對H?的轉(zhuǎn)移，并記錄IH?作為VH?的函數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VH?的變化促使了H?在PdHx和溶液之間的轉(zhuǎn)移。

其次，研究人員證實了脂雙層會產(chǎn)生屏障并阻止H?從溶液轉(zhuǎn)移到Pd表面。研究人員測量了H?通過納米孔的轉(zhuǎn)移，測量電流表明，只有極少的H?穿過了雙層膜并在Pd表面減少，這可能是由于表面缺陷造成的。接著，研究人員在溶液中加入兩個膽固醇處理修飾的DNA納米孔（6HB-2C）后，研究人員預計DNA納米孔會自發(fā)插入脂質(zhì)雙分子層，形成跨膜離子通道，但具有一個或三個膽固醇修飾的納米孔（6HB-1C和6HB-3C）不能插入脂雙層，這主要是由于疏水性需要控制在一定范圍所導致的。

如圖2b所示，納米孔的這種插入導致VH?= - 400 mV時的IH?遠大于脂雙層涂層，表明DNA納米孔為H?在脂雙層上移動提供了途徑。為了避免質(zhì)子在Pd接觸點上的積累，在第二階段中，研究人員將VH?設置為0 mV。比電解質(zhì)更高的光化學勢導致質(zhì)子釋放到電解質(zhì)中并帶正IH?。如圖2b右所示，未經(jīng)膽固醇處理的DNA納米孔沒有插入到脂雙層中，這一點得到了裸脂雙層觀察到的IH?的證實。

圖2 膜跨越DNA納米孔調(diào)控H?的示意圖

隨后，研究人員通過設計DNA序列編程DNA納米孔所需的功能，分別使用體外SELEX技術選擇生物素或DNA適配體（AP）處理納米孔，用于檢測兩種蛋白質(zhì)鏈親和素（S-avidin）和心臟生物標志物B-type natriuretic peptide（BNP）。為此，研究人員在5'端分別用生物素或AP修飾ssDNA，進而功能化6HB-2C納米孔，進行DNA雜交，以獲得6HB-2C-2B和6HB-2C-2AP。正如預期的那樣，插入到脂雙層6HB-2C-2B納米孔在VH?= -400 mV時產(chǎn)生了較大的集成電流IH?，這表明DNA納米孔內(nèi)的納米桶結(jié)構(gòu)有助于H?通過脂雙層運輸。然而，當親和素以5倍于納米孔濃度的過量濃度引入環(huán)境時，親和素與生物素在DNA納米孔上的結(jié)合事件有效地阻塞了納米管，阻礙了H?在脂雙層上的運輸，這可以通過IH?的減少來表明。

為了證實親和素確實阻斷了DNA結(jié)構(gòu)周圍的孔，研究人員將非生物素化的6HB-2C暴露于溶液中相同濃度的親和素中，并在加入蛋白質(zhì)前后進行了熒光成像實驗，結(jié)果表明親和素與生物素的結(jié)合確實阻斷了通道并導致集合電流降低。隨著親和素濃度的增加，更多的納米孔與親和素相互作用，導致更多的通道堵塞，電流下降。

然后，研究人員用6HB-2C-2AP納米孔進行了類似的實驗和對照。與生物素標記的納米孔一樣，DNA適體標記的納米孔插入脂雙層中形成跨膜離子通道，并導致H?的運輸。當BNP蛋白以5倍于納米孔濃度的濃度被引入環(huán)境時，在VH?= -400 mV時，觀察到IH?降低。這表明AP-BNP在離子通道邊緣的親和相互作用阻斷了H?的轉(zhuǎn)運。與生物素-親和素相比，AP-BNP的電流降低幅度較小，這是由于其相互作用的親和力較弱。

圖3 生物素-鏈親和素和適配體-肽的生物質(zhì)子器件示意圖

最后，為了更好地理解DNA納米孔插入脂雙層的動力學，研究人員建立了一個基于Langmuir方程和吸收/解吸動力學的模型來分析DNA納米孔在脂質(zhì)雙分子層中的插入過程，測定了IH?與引入的6HB-2C濃度、納米孔數(shù)與引入6HB-2C濃度、IH?與納米孔數(shù)及IH?與時間的曲線。

圖4 DNA納米孔表征示意圖

綜上所述，研究人員展示了一種可編程的生物質(zhì)子器件，它具有跨膜DNA納米孔離子通道作為分子互連通道，可以測量和控制H?在脂質(zhì)雙分子層界面上的轉(zhuǎn)移。該方法的特點如下：

（1）能夠利用DNA結(jié)構(gòu)的可編程性來設計納米孔并修改其表面，以電子的方式在體外感知特定的生物分子，而無需對生物分子進行額外的預處理；

（2）該方法可以同時收集來自多個通道的響應，集成方法補償了單個通道記錄中的任何變異性或異常值，從而使數(shù)據(jù)更加一致可靠；

（3）消除了與單分子器件相關的高精度設備和個性化定制的必要，簡化了器件制造和信號記錄過程。同時，該研究進行了集成實驗，建立了動態(tài)模型，探索了這種DNA納米孔結(jié)構(gòu)在生物傳感領域的潛在應用。

審核編輯：劉清