圖1：本文基于Feng et al., 2022, NIR-II Multifocal Structured Illumination Microscopy

光學顯微鏡是人類研究各種生物學問題不可或缺的強大手段。然而，生物組織的復雜組成和異質性帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)——光線在傳播過程中會被生物質散射，嚴重影響最終獲得的空間分辨率和穿透深度。

傳統(tǒng)熒光成像技術一般基于可見光(VIS:400–700 nm)和近紅外一區(qū)(NIR-I:700–1000 nm)這兩個窗口。近年來，受益于波長更長的光子在生物組織內傳播時散射率更低、近紅外二區(qū)(NIR-II:1000 1700nm)自體熒光背景更弱等優(yōu)點，基于NIR-II的熒光成像技術引起了科研人員的廣泛興趣。

在NIR-II區(qū)，科研人員可以獲得更深的生物組織穿深和更低的背景噪音;另一方面，基于InGaAs傳感器的高效短波紅外(SWIR)相機的不斷進步也極大地促進了NIR-II成像技術的廣泛應用。

受NIR-II成像優(yōu)點的啟發(fā)，科研人員又開發(fā)了幾類在NIR-Ⅱ區(qū)域發(fā)射的熒光探針以及技術，推動了NIR-II成像技術的進步。

創(chuàng)新方案

在這份工作中，科研及研發(fā)人員通過將多焦點結構照明顯微技術(MSIM)集成到NIR-II熒光顯微技術中，首次實現了NIR-II MSIM。該系統(tǒng)在高散射介質2.5mm深度處的空間分辨率達到近1.49μm。

多焦點照明模式是通過聚焦一束相位調制的高斯光束生成的，其波前由加載有計算機生成全息圖(CGH)的相位空間光調制器(SLM)整形。系統(tǒng)整體結構示意圖請見圖2。

圖2：NIR-II MSIM系統(tǒng)及原理示意圖(a)NIR-II MSIM示意圖。BE：擴束器;HWP：半波片;PBS：偏振光分離器;M1-2：反射鏡;RL1–4：中繼透鏡;RM：矩形遮罩;DM：分色鏡;OBJ，物鏡;MS：移動臺;LPF，長通濾波器，TL，管透鏡。插圖顯示CGH 在SLM平面上的輪廓(左)和在OBJ焦平面的模擬多焦圖案(右)。(b)NIR-II染料的吸收和光致發(fā)光產生的發(fā)射。(c)12×12多焦照明模式實驗結果。上邊界和右邊界對應于沿兩個正交方向的最大強度投影(MIP)方向。這里，面板(a)和(c)中的ξ和η對應目標焦平面上的笛卡爾坐標。(d)單個NIR-II染料顆粒的NIR-II WF圖像(上部插圖)和NIR-II MSIM圖像(下部插圖)的歸一化橫截面輪廓(點)和高斯擬合(線)。

通過用波長為850nm的激光激發(fā)明亮的NIR-II熒光團，該系統(tǒng)可以在0–2.5mm的成像深度范圍內以增強的空間分辨率和對比度完成圖像重建。見圖3以及圖4。

圖3：NIR-II MSIM系統(tǒng)增強分辨率示意圖。(a)、(b)分別為分散的NIR-II染料的NIR-II WF圖像和NIR-Ⅱ MSIM圖像。下圖為圖中方框部分的放大結果。(c)沿(a)和(b)下圖中所示彩色虛線的歸一化強度示意圖。(d)兩個插圖的徑向平均強度分布，為(a)、(b)上圖二維傅里葉變換的結果。

圖4：不同光譜窗口的NIR-II MSIM成像。圖像分別為通過截止波長為(a)1000nm的濾光片;(b)1300nm的濾光片的結果。(c) –(e)(a)和(b)中所示虛線的歸一化強度分布。

在更長的發(fā)射波長下獲得的結果也顯示出優(yōu)越的性能。

該工作證明了NIR-II MSIM是一種強大的生物成像觀測方法，可以提供深度穿透能力以及增強的空間分辨率和對比度。在未來，將會有更多應用于活體成像領域和跨學科研究的機會。

TPI 產品

圖5：本工作中所用到的特勵達普林斯頓儀器產品 NIRvana-HS

本工作中的科研與研發(fā)人員在采集信號時使用了來自特勵達普林斯頓儀器的NIRvana-HS近紅外相機。該相機基于InGaAs芯片開發(fā)，采用全金屬密封的真空腔、先進的深度制冷技術和強大的噪聲抑制算法，確?？蒲腥藛T獲得出色的數據。NIRvana-HS為NIRvana家族中幀速最高的產品。如果您的實驗需要高幀速紅外相機，NIRvana-HS將是您的不二之選。

審核編輯 黃宇