本文基于離心芯片采用由表面張力輔助的不混溶性結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)全血中 cfDNA 的提取。整個(gè)操作過程小于 15 min，從血漿中回收的cfDNA為 65%，從全血中回收的為 30%。

液體活檢簡(jiǎn)述見揭開液體活檢技術(shù)的神秘面紗(附視頻)

如圖 1 所示，直徑 100 mm 芯片由兩部分組成：一部分用于血漿分離和轉(zhuǎn)移，另一部分用于核酸分離。 其中，血漿分離是基于離心法實(shí)現(xiàn)的；一個(gè)漏斗狀的腔室被用于血漿提取，該腔可容納 4 mL 全血。在虹吸通道中設(shè)計(jì)有空氣閥，避免在采樣過程中血液在毛細(xì)管作用下進(jìn)入樣品腔。

圖 1

cfDNA 的提取和純化如圖 2 所示；腔室間通過拱狀毛細(xì)管微通道相互連接，其中微通道高度為 200 μm，寬度從 400 μm 到 3 mm 不等。該結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵是確保整個(gè)過程中所有相的不混溶性，并確保在磁珠轉(zhuǎn)移過程中形成穩(wěn)定的界面。

圖 2

鑒于此，本文設(shè)計(jì)了一個(gè)用于不混溶相中磁珠轉(zhuǎn)移的拱狀通道(圖 2 放大圖)。根據(jù)表面張力在微尺度上的主導(dǎo)作用，一個(gè)虛擬的 水-空氣“墻”和 空氣-油“墻” 形成，以避免在芯片靜止期間 (樣品加載和磁珠轉(zhuǎn)移時(shí))水和油的混合。

其它類似結(jié)構(gòu)見迷你樣品進(jìn)結(jié)果出核酸檢測(cè)儀(附視頻)

為了提高旋轉(zhuǎn)過程中不混溶相界面的強(qiáng)度，對(duì)空氣微腔表面進(jìn)行聚四氟乙烯處理 (Teflon treatment)，降低表面能，增加空氣介質(zhì)表面與水/油界面的張力。

在芯片啟動(dòng)加速過程中，微通道中形成了不混溶相的界面。如果角加速度過大，則當(dāng)不混溶相界面兩側(cè)的壓差超過表面張力，不混溶相界面將被破壞。

芯片實(shí)物圖如圖 3 所示。

圖 3

磁珠在外磁場(chǎng)作用下連續(xù)通過幾個(gè)不混溶界面。在磁珠轉(zhuǎn)移過程中，磁珠在外部磁力的作用下凝聚成團(tuán)。如果磁力克服界面張力，磁珠就能穿過界面。

芯片中各個(gè)腔室尺寸如圖 4 所示。

圖 4

圖 5 所示為芯片制作流程；首先由 CNC 加工模具，然后將 PDMS 涂在模具上，隨后剝離粘接在玻璃片上。

圖5

樣品加載過程如下：首先，將 4 ml 全血 (摻有 HBV 片段短 DNA) 加載到血漿分離腔中；然后將 15 μl二氧化硅包被的磁珠，1.25 ml裂解/結(jié)合緩沖液，50 μl 的洗脫液注入對(duì)應(yīng)的腔室。最后將硅油注入400 μl不混溶相腔。

本文采用硅油替代 FC-40 等氟化油是由于氟化油會(huì)導(dǎo)致氣腔表面處理的聚四氟乙烯溶解。

對(duì)于血漿分離，芯片首先被緩慢加速到一個(gè)特定的速度 (120 rpm)，以保持穩(wěn)定的不混相界面。然后將芯片加速到 3600 rpm，持續(xù) 4 min。在細(xì)胞沉降后，芯片在減速期間激活虹吸閥。隨后，分離的1.6 ml血漿樣本被離心到血漿收集腔，用于后續(xù) cfDNA 提取。

提取到血漿后，芯片開始進(jìn)行核酸提取。采用加減速將磁珠、血漿，和裂解/結(jié)合緩沖液混合，以高效地將 cfDNA 結(jié)合到磁珠表面。

隨后移動(dòng)外部磁鐵，將磁珠穿過不混溶相進(jìn)入洗脫緩沖液中。此時(shí)，純化的 cfDNA 就被帶入洗脫腔。再次采用加減速混合將核酸從磁珠表面洗脫。最后收集洗脫腔上清液用于下游檢測(cè)。如采用 定量 PCR 或數(shù)字 PCR。

圖 6

芯片首先以較低的角速度 (10 rpm/s) 啟動(dòng)，以保護(hù)不混溶相界面不發(fā)生混溶。當(dāng)角速度增加到一個(gè)特定的值(120 rpm)時(shí)，不混溶相液體離開微通道進(jìn)入腔室。然后，在 500 rpm/s 的加速度下升至 3600 rpm ，持續(xù) 4 min 實(shí)現(xiàn)血漿分離 (圖 6)。

在血漿分離腔的底部，設(shè)計(jì)了指狀結(jié)構(gòu)有助于分散芯片旋轉(zhuǎn)期間產(chǎn)生的離心壓力。

圖 7

血漿分離后，芯片以 50 rpm/s 的減速度減至 350 rpm 激活虹吸閥，然后，以 20 rpm/s 的加速度至600 rpm轉(zhuǎn)移 1.6 ml血漿到 cfDNA 提取腔(圖 7)。

隨后，進(jìn)行 cfDNA 提取。芯片首先在120 - 840 rpm 之間進(jìn)行加減速混合，持續(xù) 150 s 實(shí)現(xiàn) 磁珠、血漿，和裂解/結(jié)合緩沖液混合。之后手持磁鐵以～5mm/s 的速度手動(dòng)移動(dòng)，將腔室內(nèi)磁珠穿過不混溶的屏障進(jìn)入洗脫腔。

然后，再次在120 - 840 rpm 之間進(jìn)行加減速混合，以充分洗脫核酸。

圖 8

在血漿提取時(shí)，離心速度不能太快；如果速度太快，血細(xì)胞可能會(huì)破裂，導(dǎo)致內(nèi)部物質(zhì)釋放出來(lái)，即所謂的 溶血。

在血漿分離過程中是否發(fā)生溶血現(xiàn)象，不僅取決于離心速度，還取決于離心時(shí)間。因此，合理的離心速度和時(shí)間是極其重要的。

低離心速度和短離心時(shí)間可能導(dǎo)致分離不充分，而高離心速度和長(zhǎng)離心時(shí)間可能引起溶血現(xiàn)象。

圖9

附錄

什么是溶血？

溶血是指紅血細(xì)胞（也稱為紅細(xì)胞或血球）在一定條件下破裂和釋放其內(nèi)部的血紅蛋白和其他細(xì)胞成分的過程。這通常發(fā)生在紅細(xì)胞受到物理、化學(xué)或生物學(xué)上的壓力或損傷時(shí)。溶血可以在體內(nèi)或體外發(fā)生，具體取決于引發(fā)溶血的原因。

在體內(nèi)，溶血可能由各種原因引起，如遺傳性貧血癥、自身免疫性疾病、藥物反應(yīng)、感染等。在體外，溶血通常涉及實(shí)驗(yàn)室操作或臨床檢測(cè)，如血液分離、儲(chǔ)存和輸送過程中的意外損傷。

溶血會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白釋放到血漿中，這可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響，因?yàn)檠t蛋白可以引起腎臟損害和其他并發(fā)癥。在臨床和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，控制溶血是非常重要的，以確保血液樣本和制備的產(chǎn)物的質(zhì)量和完整性。

判斷是否發(fā)生溶血通常涉及對(duì)血液樣本或液體中的特定指標(biāo)進(jìn)行分析和觀察。以下是幾種常見的方法來(lái)判斷是否發(fā)生了溶血現(xiàn)象：

顏色變化：溶血通常會(huì)導(dǎo)致液體從紅色變成粉紅色或透明，這是因?yàn)獒尫懦龅难t蛋白會(huì)影響液體的顏色。

吸光度測(cè)量：在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，可以使用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量液體的吸光度。溶血會(huì)導(dǎo)致液體中血紅蛋白的濃度增加，從而使吸光度值升高。

紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察：可以使用顯微鏡觀察血液樣本中的紅細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)。溶血可能導(dǎo)致紅細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)紅細(xì)胞的形態(tài)也可能發(fā)生改變。

血紅蛋白測(cè)量：使用血紅蛋白測(cè)量方法，如比色法或電化學(xué)法，可以測(cè)定液體中的血紅蛋白濃度。溶血會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白濃度升高。

血漿游離血紅蛋白測(cè)定：溶血會(huì)釋放血漿中的游離血紅蛋白。通過測(cè)量游離血紅蛋白的濃度，可以判斷是否發(fā)生了溶血。

細(xì)胞膜標(biāo)記物測(cè)定：可以通過測(cè)量紅細(xì)胞膜上的特定標(biāo)記物的濃度，如LDH（乳酸脫氫酶）和鉀離子，來(lái)判斷紅細(xì)胞是否受損和是否發(fā)生了溶血。

審核編輯：劉清