近期，中國科學(xué)院廣州健康院張驍研究員團(tuán)隊提出一種基于結(jié)構(gòu)微流體創(chuàng)新的譜系細(xì)胞單克隆自動化獲取策略，以無標(biāo)記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式，在體細(xì)胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中實現(xiàn)了對特定譜系的單克隆性細(xì)胞的自動化獲取，并研發(fā)出基于結(jié)構(gòu)微流體的細(xì)胞單克隆獲取整機(jī)技術(shù)（圖1）。

圖1 自動化譜系細(xì)胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機(jī)技術(shù)概要

該原創(chuàng)性策略被部署于廣州健康院前期自主研發(fā)的自動化干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)裝備，提高了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）單克隆的獲取效率與純度，提升了系統(tǒng)魯棒性（robustness）及縮短了體細(xì)胞重編程后持續(xù)純化hiPSCs（sub-cloning）的建系周期。相關(guān)研究成果以“Selecting Monoclonal Cell Lineages from Somatic Reprogramming Using Robotic-Based Spatial-Restricting Structured Flow”為題發(fā)表在Research期刊上。

盡管譜系節(jié)點細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景廣闊，但基于傳統(tǒng)人為操作獲取譜系細(xì)胞單克隆的方法需要消耗大量時間和勞動力，獲取效率通常比較低，且無法以無標(biāo)記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式獲取譜系細(xì)胞單克隆。此外，利用微流控技術(shù)雖然可以提高譜系細(xì)胞收獲效率，但這種方法無法獲得基于譜系特異性的細(xì)胞單克隆。因此，發(fā)展能夠高效富集譜系細(xì)胞單克隆的自動化整機(jī)技術(shù)顯得尤為重要。

細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-基質(zhì)之間的粘附力變化是譜系細(xì)胞命運變化中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)節(jié)流體剪切力大小可以實現(xiàn)以無標(biāo)記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式分離/選擇具有不同粘附特性的譜系細(xì)胞單克隆，這種策略可以應(yīng)用于基于細(xì)胞類型特異性的單克隆工程化獲取。張驍研究員團(tuán)隊前期研究中利用AI算法實現(xiàn)了對重編程細(xì)胞單克隆的識別和預(yù)測，并將AI技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)儀器整機(jī)技術(shù)研究。該團(tuán)隊在前期依托中國科學(xué)院廣州健康院研發(fā)出了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的自動化干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)設(shè)備，憑借這些研究背景，結(jié)合整機(jī)技術(shù)和分子組織生物學(xué)認(rèn)知以及空間結(jié)構(gòu)微流體操控技術(shù)，該團(tuán)隊研發(fā)了自動化整機(jī)，通過以編程的方式精確操控結(jié)構(gòu)微流體，并產(chǎn)生具有空間定位的流體剪切力，實現(xiàn)在復(fù)雜高異質(zhì)性的細(xì)胞環(huán)境中通過流體變化選擇特定的細(xì)胞類型，并實現(xiàn)譜系細(xì)胞單克隆的特異性獲取。

通過分析不同體細(xì)胞重編程過程中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)水平變化情況，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞多能性基因的表達(dá)水平與Integrin家族基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，而與Cadherin家族基因的表達(dá)量呈正相關(guān)性。由于Integrins是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用的關(guān)鍵粘附分子，而Cadherins是細(xì)胞與細(xì)胞之間相互連接的重要分子，這意味著體細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)變成多能干細(xì)胞這一譜系命運變化過程中，細(xì)胞與ECM的連接可能會減弱，而細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接可能會增強(qiáng)。為了證明這個假設(shè)，張驍研究員提出進(jìn)一步通過設(shè)計平行平板流動腔實驗和免疫熒光實驗來進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果與預(yù)期假設(shè)相一致，并且平行平板流動腔實驗初步證明了流體剪切力有望成為分離/選擇特定類型粘附細(xì)胞的好技術(shù)路徑（圖2）。

圖2體細(xì)胞重編程中細(xì)胞譜系命運變化伴隨著粘附分子表達(dá)的改變，流體剪應(yīng)力可用于分離粘附細(xì)胞

隨后，論文第一作者陳學(xué)平博士基于流體動力學(xué)原理設(shè)計了可以產(chǎn)生局部結(jié)構(gòu)微流體的細(xì)胞獲取微型挑針結(jié)構(gòu)（PTMS），團(tuán)隊克服了流場效果與多曲面加工實現(xiàn)的難題，反復(fù)校驗加工結(jié)構(gòu)，最終基于PTMS產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)微流體（PTMS-FLOW）實現(xiàn)了對基于空間限位譜系細(xì)胞的特異性挑取。此外，研究證明了PTMS-FLOW可根據(jù)流速變化在Z軸-h0的為常量的條件下，應(yīng)對不同細(xì)胞類型的粘附力差異，實現(xiàn)以無標(biāo)記、無酶活反應(yīng)參與、非侵入式、和非接觸的方式對不同譜系細(xì)胞進(jìn)行特異性的選擇。該研究證明了結(jié)構(gòu)微流體是作為分離/選擇特定譜系類型粘附細(xì)胞的可自動化的技術(shù)路徑，為后續(xù)進(jìn)一步研究譜系細(xì)胞單克隆的自動化獲取提供了理論基礎(chǔ)（圖3）。

圖3 基于空間定位的結(jié)構(gòu)微流體研究不同譜系細(xì)胞的粘附分離作用

為了將上述策略應(yīng)用于對體細(xì)胞重編程過程中特定譜系的細(xì)胞的自動化獲取，研究團(tuán)隊通過克服機(jī)械模塊控制和精準(zhǔn)調(diào)度的難題，結(jié)合細(xì)胞光學(xué)成像和自適應(yīng)算法，實現(xiàn)精準(zhǔn)操控微結(jié)構(gòu)的功能底部與細(xì)胞單克隆之間的Z軸間距和水平位移，從而確保精準(zhǔn)操控PTMS-FLOW作用于單克隆性的譜系細(xì)胞上，以此實現(xiàn)在體細(xì)胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中快速獲取hiPSCs細(xì)胞單克隆的目標(biāo)（圖4）。

圖4 研發(fā)自動化譜系細(xì)胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機(jī)技術(shù)

此外，研究團(tuán)隊借助自動化整機(jī)技術(shù)的精確的流體操控能力，設(shè)計了一種雙挑模式（Dual Run Selection），通過使用兩次不同強(qiáng)度的剪切流體分別獲取不同類型粘附特性的譜系細(xì)胞，實現(xiàn)了對特定空間位置的hiPSCs譜系細(xì)胞單克隆的特異性選擇（圖5），并能為下游hiPSCs實現(xiàn)特異性擴(kuò)增提供純化（sub-cloning）能力。

圖5 基于譜系細(xì)胞粘附力的差異，應(yīng)用PTMS-FLOW實現(xiàn)了對重編程多能干細(xì)胞單克隆的選擇

綜上所述，研究團(tuán)隊提出一種基于微型挑針結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PTMS-FLOW實現(xiàn)了以無標(biāo)記、無酶活反應(yīng)參與、和非侵入式的方式快速獲取譜系細(xì)胞單克隆的目標(biāo)，并研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的譜系細(xì)胞單克隆自動化獲取的整機(jī)技術(shù)。該整機(jī)技術(shù)通過大幅減少譜系細(xì)胞生成過程中的時間成本，以及人工操作量，使得譜系細(xì)胞獲取和培養(yǎng)起來更簡單。該研究為自動化生產(chǎn)特定譜系細(xì)胞用于臨床干預(yù)提供了新的技術(shù)方案，并為再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供更多自動化獲取譜系細(xì)胞的工具，從而從技術(shù)手段和方法學(xué)方面促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用落地。

論文鏈接：

https://doi.org/10.34133/research.0338