在過去幾十年，全球經(jīng)歷了多次嚴(yán)重的病毒大流行，如2009年的豬流感病毒、2013-2016年的埃博拉病毒、2015-2016年的寨卡病毒以及2019年末開始的COVID-19病毒等。這些疫情導(dǎo)致了大量人員失去生命，造成重大的經(jīng)濟(jì)和社會損失。目前，可用的大多數(shù)病毒檢測方法大多靶向特定的病毒核酸和蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。然而，這些方法要么需要復(fù)雜的PCR操作，要么就是靈敏度和可靠性較差。

近期，美國加州大學(xué)（University of California）的Holger Schmidt教授，楊百翰大學(xué)（Brigham Young University）的Aaron R. Hawkins教授和得克薩斯生物醫(yī)學(xué)研究所（Texas Biomedical Research Institute）的Jean L. Patterson教授在期刊Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上聯(lián)合發(fā)表了一篇題為“Label-free and amplification-free viral RNA quantification from primate biofluids using a trapping-assisted optofluidic nanopore platform”的工作，報告了一種集成的光流控納米孔平臺，用于對各種生物樣品液體中病毒的RNA載量進(jìn)行無標(biāo)記和無擴(kuò)增的定量測定。

先前，該團(tuán)隊(duì)報道過一種用于納米孔檢測的光流控方法，即借助捕獲區(qū)域輔助提高捕獲率的技術(shù)（trapping-assisted capture rate enhancement，TACRE），并將其應(yīng)用于合成低聚物和鼻拭子樣本中的SARS-CoV-2 RNA。該方法是基于將核酸靶標(biāo)固相提取到微珠上用于確保檢測的特異性，然后這些微珠被光捕獲至納米孔的電捕獲半徑內(nèi)，在那里靶標(biāo)可被熱釋放并快速連續(xù)地通過納米孔易位。在本工作中，該團(tuán)隊(duì)報告了這一技術(shù)概念作為臨床診斷工具的驗(yàn)證，對靈長類動物模型中的病毒——寨卡病毒和SARS-CoV-2進(jìn)行研究。

首先，研究人員構(gòu)建了如圖1所示的納米孔集成光流控平臺和實(shí)驗(yàn)裝置。20 nm直徑的納米孔隙位于凸起上方的氧化膜中（T4時間點(diǎn)附近），Ag/AgCl電極在納米孔②和出口③之間產(chǎn)生電勢差，膜片鉗電流放大器與電極連接，以測量納米孔上的離子電流信號。與先前的TACRE工藝不同的是，本工作設(shè)計(jì)將磁珠推入凸起中，阻止磁珠暴露在流體流動中，減小磁珠上所釋放的靶標(biāo)被沖走的可能性，從而進(jìn)一步降低檢測的LOD。如圖所示，理論上將攜帶靶標(biāo)的微珠遞送至納米孔的過程可分為四個不同的時間點(diǎn)（T1-T4），在此期間，微珠將受到各種力的組合作用，如Ff（流體流動力），F(xiàn)g（梯度力）和Fs（散射力，作用于光傳播的方向）。可以看到，當(dāng)散射力超過流體流動力時，珠子將被推入凸起。在凸起內(nèi)部，僅Fs發(fā)揮作用，這促進(jìn)了磁珠被有效地光捕獲在納米孔附近。隨后，通過熱釋效應(yīng)，靶分子便能迅速被納米孔檢測。

圖1 納米孔集成光流體平臺及其工作原理示意圖。

隨后，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了基于磁珠的固相提取方法來從復(fù)雜的生物流體中（全血、尿液、精液）提取特定的病毒RNA。該固相萃取過程首先是通過基于鏈霉親和素-生物素的附著過程，將磁珠表面修飾上具有標(biāo)靶特異性的下拉序列。然后，將已知數(shù)量的功能化微珠與RNA樣品混合，直到珠子上收集了所有靶標(biāo)。后續(xù)，這些磁珠的一部分將會被光學(xué)捕獲在納米孔附近，其表面的靶RNA會被熱釋放進(jìn)而檢測。為了定量病毒RNA的濃度，該團(tuán)隊(duì)根據(jù)每個微珠上附著的病毒RNA估計(jì)數(shù)量、生物流體中RNA數(shù)量、與RNA樣品混合的珠子總數(shù)等，估算出根據(jù)TACRE方法得到的病毒RNA濃度的計(jì)算公式。

圖2 生物流體裂解和RNA提取流程示意圖。

圖3A展示了當(dāng)空磁珠（無靶標(biāo)）被光學(xué)捕獲并在加熱后的納米孔電流信號，結(jié)果顯示無假陽性信號。接著，該團(tuán)隊(duì)以狨猴精液樣本為例進(jìn)行了TACRE測定，并以PCR的結(jié)果作為獨(dú)立參考。在光學(xué)捕獲階段，4個攜帶靶標(biāo)的磁珠被捕獲在納米孔附近，熱釋放后，納米孔采集到的特征易位信號如圖3B所示，最終共有2620個易位信號被觀察到。計(jì)算得到的病毒濃度，與qPCR的參考值相近。

圖3 利用寨卡病毒感染狨猴的精液樣本進(jìn)行的捕獲率提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣本是在接種后第 9 天采集的。

最后，該團(tuán)隊(duì)將該檢測方案應(yīng)用于寨卡病毒和SARS-CoV-2的綜合縱向研究，以跟蹤四周內(nèi)多個生物體液樣本感染過程中的病毒載量。通過比較三種樣品的納米孔測量結(jié)果和qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米孔測得的值與qPCR參考值具有良好的一致性，且納米孔傳感器所獲得的病毒濃度值始終高于qPCR的結(jié)果。而這可能是因?yàn)闊o需逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等可能丟失靶標(biāo)的操作。

圖4 利用光流控納米孔平臺進(jìn)行的臨床生物流體縱向TACRE研究。

綜上所述，研究人員展示了一種集成的光流控納米孔平臺，用于臨床生物流體樣本中病毒RNA的無標(biāo)記和無擴(kuò)增定量檢測。采用優(yōu)化后的固相提取方法，研究人員將病毒的RNA固定于微珠表面，從而簡化并增強(qiáng)了目標(biāo)分離的選擇性。利用光學(xué)捕獲系統(tǒng)，微珠被精準(zhǔn)遞送到納米孔傳感器旁，并通過熱激活手段迅速釋放目標(biāo)顆粒。這一過程將局部目標(biāo)顆粒的濃度大幅提升至100萬倍以上，極大地加速了診斷速度，并且支持高通量檢測。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2400203121