文章來(lái)源：老千和他的朋友們

原文作者：孫千

本文介紹了共聚焦拉曼顯微鏡。

“拉曼光譜是一種弱散射技術(shù)，通常不到百萬(wàn)分之一的激發(fā)光子會(huì)產(chǎn)生一個(gè)拉曼光子。這種情況在共聚焦拉曼顯微鏡中更加困難，因?yàn)樘綔y(cè)體積被小針孔縮小，必須在短時(shí)間內(nèi)收集成千上萬(wàn)的光譜。因此，精細(xì)的設(shè)計(jì)激發(fā)和探測(cè)光學(xué)器件，以及適當(dāng)選擇光譜儀和探測(cè)器對(duì)于成功的實(shí)驗(yàn)非常重要?！?/p>

1引言

拉曼散射通常是一種非常微弱的效應(yīng)，因?yàn)榧ぐl(fā)的光子與參與散射過(guò)程的分子之間存在非諧振的相互作用。因此，在一個(gè)給定的測(cè)量幾何中，拉曼光子的數(shù)量是有限的，任何提高光子收集效率的技術(shù)進(jìn)步都是非常重要的。盡管拉曼效應(yīng)在1928年已經(jīng)由Chandrasekara-Raman發(fā)現(xiàn)（兩年后被授予諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)），但常規(guī)的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)直到1960年代激光的發(fā)展才得以實(shí)現(xiàn)。

在20世紀(jì)70年代和80年代，電荷耦合器件（CCD）的發(fā)展取代了光電倍增管（PMT），實(shí)現(xiàn)了多通道探測(cè)。WillardS. Boyle和George E. Smith因發(fā)明了CCD相機(jī)而獲得2009年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

由于硅探測(cè)器在光譜的可見(jiàn)和近紅外區(qū)域與PMT相比具有更高的量子效率（QE），而且CCD可以作為線(xiàn)性探測(cè)器使用，這使得測(cè)量時(shí)間至少減少了三個(gè)數(shù)量級(jí)。以前，感興趣的拉曼波段必須在一個(gè)PMT上掃描，一個(gè)點(diǎn)探測(cè)器只對(duì)光譜儀出口狹縫所選擇的非常窄的波長(zhǎng)范圍敏感。隨著CCD的引入，光譜儀的出口狹縫可以由一個(gè)線(xiàn)性CCD探測(cè)器重新放置，從而可以同時(shí)采集超過(guò)1000個(gè)通道。

2拉曼顯微鏡的發(fā)展

在90年代，一些公司首次將拉曼光譜儀與光學(xué)顯微鏡結(jié)合起來(lái)，光學(xué)顯微鏡被用來(lái)將激發(fā)光聚焦到一個(gè)直徑為幾微米的小點(diǎn)上，以便從更小區(qū)域獲得拉曼光譜。這是第一次從直徑只有幾微米的區(qū)域中獲得拉曼光譜。物高NA的物鏡對(duì)拉曼信號(hào)的高效率收集有好處，另一方面，當(dāng)人們把光聚焦到一個(gè)小區(qū)域或點(diǎn)上時(shí)，必須注意不要用過(guò)于強(qiáng)烈的激光束加熱樣品和熱破壞它。

在另一種方法中，光鏡—拉曼聯(lián)用儀器配有步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的定位臺(tái)，以光柵掃描樣品并收集拉曼光譜，這種被稱(chēng)為拉曼光譜的技術(shù)可以用來(lái)從每個(gè)光譜中提取相關(guān)的化學(xué)信息，并以幾微米的橫向分辨率繪制樣品中化學(xué)成分的分布圖。

由于使用這些儀器采集典型的拉曼光譜可能需要幾秒鐘的積分時(shí)間(或者甚至更長(zhǎng)，取決于所需的信噪比和樣品的散射效率)，一般認(rèn)為這種技術(shù)非常慢，并且采集樣品的拉曼圖需要幾個(gè)小時(shí)。如果使用每個(gè)頻譜僅1秒的積分時(shí)間，則60×60像素拉曼圖僅積分就需要60×60=3600s，1h。加上用步進(jìn)電機(jī)定位樣品所需的時(shí)間，以及CCD的讀出時(shí)間和反向掃描的時(shí)間，該實(shí)驗(yàn)所需的總時(shí)間很容易就會(huì)增加一倍。

保持系統(tǒng)穩(wěn)定，并在這一時(shí)間尺度上獲得優(yōu)于1微米的精度是一個(gè)挑戰(zhàn)，60X60像素的地圖只是一個(gè)很小的圖像，如果是200×200 = 40000像素光譜圖，在每個(gè)頻譜的積分時(shí)間不顯著降低的情況下，生成拉曼圖幾乎是不可能完成的任務(wù)，只有每個(gè)光譜的積分時(shí)間必須減少到100毫秒甚至更少才行。

因此，開(kāi)發(fā)了多路設(shè)置來(lái)提高采集速度，類(lèi)似于從單點(diǎn)、零維PMT到一維CCD的轉(zhuǎn)換。

一種想法是照射一條完整的線(xiàn)，并將這條線(xiàn)投射到光譜儀的入射狹縫上并掃描整個(gè)樣品。CCD相機(jī)的垂直軸可用于位置信息，水平軸用于能量分散。利用這種技術(shù)，人們可以同時(shí)獲得沿著照明線(xiàn)的數(shù)百個(gè)光譜，這種技術(shù)被稱(chēng)為“線(xiàn)成像”。

另一種方法是將光通過(guò)(可調(diào)諧的)窄帶濾光片發(fā)送到成像CCD上，從而將樣品作為一個(gè)整體均勻照射，并在沒(méi)有分光計(jì)的情況下獲取所需的光譜信息。單次曝光收集整個(gè)樣品的拉曼光，并且不再需要掃描。這種模式不可能在每個(gè)圖像點(diǎn)收集完整的拉曼光譜，相反，光譜信息必須通過(guò)在不同的濾波器通帶位置拍攝幾幅圖像來(lái)獲得，這種技術(shù)被稱(chēng)為“全局成像”。

盡管這些技術(shù)將探測(cè)速度提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，但它們具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)，在大多數(shù)情況下妨礙了它們的有用應(yīng)用。一個(gè)主要的缺點(diǎn)是這兩種技術(shù)都不是共焦的，因此要么有狹縫而不是圓形針孔，要么根本沒(méi)有針孔。

“共焦”被定義為“具有相同的焦點(diǎn)”，其中用點(diǎn)光源照射樣品，并通過(guò)探測(cè)器前面的針孔探測(cè)該點(diǎn)的圖像。照明點(diǎn)光源和針孔都位于同一焦平面上。通過(guò)在樣品上逐點(diǎn)和逐行掃描激光焦點(diǎn)，或者通過(guò)在激光點(diǎn)下掃描樣品，可以獲得樣品的圖像。由于信號(hào)是通過(guò)針孔探測(cè)的，因此只有來(lái)自焦平面的光才能到達(dá)探測(cè)器。在焦平面之上或之下發(fā)射的光在針孔平面中沒(méi)有聚焦，因此對(duì)圖像沒(méi)有貢獻(xiàn)。

3共焦

拉曼光譜的最大干擾因素是熒光。由于熒光是光與電子樣品態(tài)的共振相互作用，熒光的效率可以很容易地比拉曼相互作用的效率高6個(gè)數(shù)量級(jí)。如果樣品在用于拉曼的激發(fā)波長(zhǎng)下顯示熒光，在大多數(shù)情況下，熒光強(qiáng)度如此之高以至于不能探測(cè)到拉曼信號(hào)。

因此，通過(guò)使用不顯示樣品熒光的激發(fā)波長(zhǎng)，或者減少探測(cè)體積，盡可能減少熒光背景是極其重要的。

不幸的是，不可能總能找到?jīng)]有熒光的激發(fā)波長(zhǎng)，因?yàn)榕c拉曼散射相比，熒光過(guò)程效率高。在這些情況下，共焦探測(cè)裝置將熒光的收集限制在從焦平面發(fā)射的光子，這將急劇地減少熒光背景信號(hào)，從而在許多情況下可以獲得拉曼圖像。如果熒光是由雜質(zhì)而不是樣品本身引起的，共焦拉曼圖像通常給出非常有用的結(jié)果，而非共焦技術(shù)仍然會(huì)從焦平面上方和下方的區(qū)域收集的過(guò)多的熒光。

由于共焦探測(cè)原理將探測(cè)到的光限制在焦平面上，所以它還可以進(jìn)行3D和透明樣品的光學(xué)截面分析（不將樣品切成兩半）。如果樣品是支撐基底上的薄層，共焦設(shè)置允許樣品信號(hào)與背底信號(hào)分離。比如，蓋玻片(170μm厚)上厚度小于1μm的聚合物樣品，產(chǎn)生的拉曼信號(hào)比玻璃基材本身小100倍以上，非共焦技術(shù)幾乎無(wú)法進(jìn)行分析。

非共焦技術(shù)或許有其獨(dú)特的應(yīng)用，但共焦技術(shù)在空間分辨率和背景抑制方面可提供最佳的結(jié)果。

4共焦拉曼顯微鏡的通量

因?yàn)槔盘?hào)非常弱，所以?xún)?yōu)化共焦拉曼顯微鏡的通量以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行共焦拉曼成像是非常重要的。圖1顯示了由激發(fā)激光器、顯微鏡和帶有CCD探測(cè)器的光譜儀組成的典型拉曼顯微鏡系統(tǒng)示意圖。樣品的掃描運(yùn)動(dòng)由壓電掃描器執(zhí)行，當(dāng)配備位置傳感器時(shí)，該掃描器非常快速且極其精確。

為了優(yōu)化拉曼信號(hào)，系統(tǒng)的每個(gè)部分都必須針對(duì)最高的傳輸和效率進(jìn)行優(yōu)化。如果元件選擇不當(dāng)，靈敏度很容易下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。如果需要單個(gè)光譜，通常所需的積分時(shí)間是1s還是10s并不重要，但如果一幅圖像需要15分鐘或2.5小時(shí)，則差別很大。

圖1帶有光纖耦合激光源和光譜儀的拉曼顯微鏡的典型

4.1激光的波長(zhǎng)

拉曼散射強(qiáng)度正比于ν4，ν是激發(fā)激光輻射的頻率。因此，400nm的激光比800nm的激光產(chǎn)生高16倍的拉曼信號(hào)。另一方面，許多樣品在紫外或藍(lán)色區(qū)域被激發(fā)時(shí)具有強(qiáng)熒光，而在紅色或NIR區(qū)域被激發(fā)時(shí)具有低熒光。

激發(fā)波長(zhǎng)越短，橫向分辨率越高，因?yàn)榉直媛视上率浇o出d=0.61λ/NA，d是兩點(diǎn)之間最短的可分辨距離，λ是波長(zhǎng)，NA是所用物鏡的數(shù)值孔徑。這個(gè)關(guān)系也表明數(shù)值孔徑同樣重要。在400到900 nm的范圍內(nèi)，高NA物鏡容易獲得。350 nm以下的UV波長(zhǎng)，拉曼散射高，但可用物鏡數(shù)量有限。此外，高能量光子會(huì)造成樣品損壞，也成為一個(gè)問(wèn)題。在長(zhǎng)波長(zhǎng)下，橫向分辨率降低，拉曼效率大幅下降，但熒光不太可能出現(xiàn)。

適用于拉曼顯微鏡的激光器應(yīng)該具有：高斯光束形狀，可以聚焦到衍射受限的點(diǎn)；線(xiàn)性偏振，以允許觀察偏振相關(guān)的樣品特性；具有遠(yuǎn)低于1cm-1的窄線(xiàn)形，以避免加寬拉曼譜線(xiàn)；頻率穩(wěn)定(變化<0.01cm-1)，以允許高精度的應(yīng)力測(cè)量；強(qiáng)度穩(wěn)定(<1–2%的功率波動(dòng))，以實(shí)現(xiàn)精確和濃度的測(cè)量。

另外，拉曼信號(hào)與激發(fā)功率成正比，但可接受的激光功率取決于激光波長(zhǎng)、樣品特性(吸收、導(dǎo)熱性等)和其他成像條件(激光焦點(diǎn)直徑等)。功率可以從uW變化到幾百mW。如果樣品是透明的，對(duì)于300 nm的光斑尺寸，綠色激光可接受的功率約是10 mW。

4.2物鏡

為了獲得最高的收集效率和最佳的空間分辨率，應(yīng)使用高數(shù)值孔徑的物鏡。好的物鏡在500nm波長(zhǎng)下有80–90%的透射率，但在900nm波長(zhǎng)下只有40%甚至更少。其原因在于，對(duì)可見(jiàn)光中具有小于0.5%反射率的抗反射涂層在紅外中的反射率會(huì)高得多。這一點(diǎn)特別重要，因?yàn)楣饩€(xiàn)必須穿過(guò)物鏡兩次。

選擇物鏡時(shí)，還需要考慮樣品的平坦度，因?yàn)楦逳A物鏡具有良好的深度分辨率（適合高度平整的樣品），這意味著，具有高低起伏形貌的樣品有時(shí)會(huì)聚焦在樣品表面上，而有時(shí)不會(huì)。這種情況下，使用低NA的物鏡可能是有益的。

4.3顯微鏡的通量

顯微鏡的通量與物鏡的通量一樣重要。光必須通過(guò)顯微鏡兩次，因此損耗是平方的，具有優(yōu)化通量的光學(xué)組件損耗更低。用二向色或全息分束器將激光束耦合到顯微鏡中，該分束器對(duì)于激光激發(fā)波長(zhǎng)的反射率應(yīng)該盡可能高，而對(duì)于拉曼光的透射率也應(yīng)該高?，F(xiàn)在的涂層技術(shù)，可以獲得具有反射性的二向色濾光器（透過(guò)率>95%），對(duì)于150rel.cm-1以上的斯托克斯位移拉曼光的透射率約98%。只有在探測(cè)到反斯托克斯拉曼光譜時(shí)，才需要全息濾光片。

為了有效地抑制瑞利線(xiàn)，應(yīng)該使用一個(gè)邊緣或槽口濾波器，它可以將激光線(xiàn)強(qiáng)度降低6個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)對(duì)斯托克斯偏移的拉曼線(xiàn)有一個(gè)>95%的通過(guò)率。

4.4顯微鏡和光譜儀之間的耦合

顯微鏡和光譜儀之間的光學(xué)耦合極其重要，必須將顯微鏡發(fā)出的光有效地耦合到光譜儀中。如果用平均反射率為85%的金屬鏡，經(jīng)過(guò)4面鏡子之后，信號(hào)就損失了50%。

此外，光必須耦合到分光計(jì)的入射狹縫中，并且其孔徑必須轉(zhuǎn)換成分光計(jì)的入射孔徑。比分光計(jì)接收角更大的發(fā)散度將導(dǎo)致巨大的信號(hào)損失，更小的發(fā)散度將導(dǎo)致分辨率降低，因?yàn)楣鈻艃H被部分照射。

如何達(dá)到有效的共焦？共焦針孔的尺寸須根據(jù)物鏡像的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)直徑來(lái)選擇。例如，在633 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，NA = 0.9的X100物鏡，會(huì)在像平面中產(chǎn)生43μm的衍射受限艾里斑。此時(shí)，50μm的共焦針孔直徑是理想選擇（最大深度分辨率和高收集效率）。

為了避免信號(hào)損傷，通常選擇一根芯徑為50微米的多模光纖。該光纖可作為：

1.一個(gè)針孔，因?yàn)橹挥泻诵牟糠挚梢砸龑?dǎo)和傳輸光。

2.一個(gè)效率極高的導(dǎo)光板（如果使用無(wú)涂層的入口和出口表面，唯一的損失是4%的入口和出口損失）。

3.作為光譜儀的入口狹縫和作為一個(gè)光圈匹配裝置。光纖的出口光圈（NA=0.12）與光譜儀的光圈完全匹配。

目前，大多數(shù)市售光譜儀的通量（包括光柵）只有30-35%（@532 nm），盡管光柵的效率高達(dá)80%。這意味著超過(guò)50%的光在光譜儀鏡面的涂層中損失了，其原因是大多數(shù)光譜儀沒(méi)有針對(duì)拉曼信號(hào)的小頻率范圍進(jìn)行優(yōu)化（優(yōu)化可以提高一倍）。

4.5光柵

光譜儀中的光柵通過(guò)將每個(gè)波長(zhǎng)以略微不同的角度偏轉(zhuǎn)，將信號(hào)分散到CCD探測(cè)器上。高數(shù)量的溝槽/毫米（線(xiàn)/毫米）會(huì)導(dǎo)致高分散性和高分辨率，但也將信號(hào)分布在大量的CCD像素上。對(duì)于典型的樣品，用于共焦拉曼顯微鏡的最窄線(xiàn)的寬度（FWHM=半最大值全寬）不低于2-3cm-1。因此，分辨率約為1cm-1的光譜儀是折衷選擇。

有多個(gè)光柵可以切換是非常有用的，這樣就可以使用一個(gè)與探測(cè)器尺寸匹配的光柵，以確保探測(cè)器覆蓋全部拉曼光譜（100至3600rel.cm-1），以及提供約1cm-1分辨率的高分辨率光柵。

為了優(yōu)化效率，光柵通常是針對(duì)某一波長(zhǎng)，這意味著溝槽是有角度的，這樣光柵的效率在第一衍射階數(shù)上可以達(dá)到80%。光柵效率設(shè)定了光譜儀的通量的上限。圖中顯示了一個(gè)600線(xiàn)/毫米的光柵效率，波長(zhǎng)為500nm。

可以看出，光柵效率在某一波長(zhǎng)處達(dá)到峰值，并在較短的波長(zhǎng)處顯示出強(qiáng)烈的下降。在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)下，下降幅度較小，但如果該光柵在785nm的激發(fā)下使用，其效率會(huì)降低2-3倍。

圖2典型的絕對(duì)反射效率，對(duì)于600線(xiàn)/毫米光柵的500nm的非偏振光的一階反射

4.6 電荷耦合器件（CCD）探測(cè)器

CCD探測(cè)器是拉曼顯微鏡的關(guān)鍵部件，其對(duì)儀器的性能影響很大。CCD相機(jī)有各種各樣的探測(cè)器尺寸，非冷卻或帶珀?duì)柼蛞旱↙N）冷卻，正面或背面照明，作為深耗損模型或帶紫外線(xiàn)涂層，這只是數(shù)百種變化中的幾個(gè)。

CCD探測(cè)器由一個(gè)光敏硅-光電二極管陣列組成，每個(gè)都與一個(gè)電容器相連。在光電二極管中，每一個(gè)探測(cè)到的光子都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電子-空穴對(duì)，這些空穴對(duì)被內(nèi)部電場(chǎng)分離，電子被儲(chǔ)存在電容器中。分光探測(cè)器的典型探測(cè)器尺寸是1024X127像素，像素尺寸為26微米X26微米。

探測(cè)器的第一個(gè)重要特征是其量子效率（QE）。QE是指探測(cè)到的光子占總?cè)肷涔庾拥陌俜直?。由于CCD的感光區(qū)被電氣互連線(xiàn)部分阻擋，典型的CCD（正面照明）探測(cè)器的QE在500nm時(shí)約為45%。為了提高探測(cè)效率，背照式CCD設(shè)備被開(kāi)發(fā)出來(lái)，這意味著它們被蝕刻到約17微米的厚度，光線(xiàn)從背面進(jìn)入。通過(guò)這種技術(shù)和適當(dāng)?shù)姆婪瓷洌ˋR）涂層，可達(dá)到90%以上的QE（@500nm）。

典型的正面和背面發(fā)光的探測(cè)器的QE曲線(xiàn)的比較見(jiàn)圖3。

圖3背照式（黑色）、背照式深耗損（紅色）和前照式（藍(lán)色）CCD探測(cè)器的典型QE曲線(xiàn)與波長(zhǎng)的關(guān)系

QE決定了拉曼實(shí)驗(yàn)中探測(cè)到的信號(hào)。但信號(hào)中的噪聲或探測(cè)器本身產(chǎn)生的噪聲同樣重要。因?yàn)樾旁氡龋⊿/N）決定了測(cè)量的質(zhì)量。理想情況下，噪聲應(yīng)該由信號(hào)本身的射出噪聲所主導(dǎo)。其他每一個(gè)噪聲源應(yīng)盡可能小。

熱噪聲是由探測(cè)器本身的熱激發(fā)載流子產(chǎn)生的，可以通過(guò)冷卻探測(cè)器（珀?duì)柼鋮s器）來(lái)大大減少。在60℃時(shí)，對(duì)于背照式CCD來(lái)說(shuō)，由熱激發(fā)電子引起的典型背景信號(hào)為0.01電子/像素/秒。因此，如果探測(cè)器保持在60℃或更低的溫度，熱噪聲（即熱產(chǎn)生的電子數(shù)的平方根）可以在幾分鐘的積分時(shí)間內(nèi)被消除掉。熱噪聲通常不是一個(gè)限制性因素。

更重要的是探測(cè)器本身的讀出放大器的讀出噪聲。讀出噪聲以電子表示，取決于讀出放大器的質(zhì)量以及讀出速度。對(duì)于較長(zhǎng)的積分時(shí)間(>50毫秒），一個(gè)慢速讀出放大器就足夠了。一個(gè)高端的33kHz讀出放大器產(chǎn)生的噪聲小于4個(gè)電子。在100kHz的讀出速度下，最好的相機(jī)的讀出噪聲在10個(gè)電子左右，而在2.5MHz的讀出速度下，它可以很容易地達(dá)到35個(gè)電子。

使用一個(gè)1024x127像素的探測(cè)器和一個(gè)33kHz的讀出放大器，最小的積分時(shí)間將是大約32毫秒（31個(gè)光譜/秒）。一個(gè)由256條線(xiàn)組成的圖像，每條線(xiàn)有256個(gè)光譜（65635個(gè)光譜），用這個(gè)積分時(shí)間獲得的圖像將需要大約2100秒=35分鐘的采集時(shí)間。

如果使用100kHz的讀出放大器，最小積分時(shí)間從32秒減少到大約12毫秒（83個(gè)光譜/秒），可以在13分鐘內(nèi)獲得圖像，但此時(shí)的讀出噪聲等于100電子/像素。

如使用2.5MHz的讀出放大器，積分時(shí)間可減少到1毫秒（1000個(gè)光譜/秒），采集時(shí)間可以低至1分鐘，但可用的信號(hào)減少了32倍，讀出噪聲急劇增加。

在非常短的積分時(shí)間（快速掃描），讀出噪聲開(kāi)始支配所有其他的噪聲源。

理想情況下，人們希望有一個(gè)具有100% QE的探測(cè)器，沒(méi)有熱噪聲，沒(méi)有讀出噪聲或任何其他噪聲源。這種理想的探測(cè)器將總是被射出噪聲限制，這是在物理學(xué)允許的范圍內(nèi)最好的。如果使用長(zhǎng)積分時(shí)間，具有良好冷卻效果的背照式CCD就非常接近于這種理想的探測(cè)器。

最近CCD技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了一種更接近理想探測(cè)器的探測(cè)器（至少在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)是如此），這種探測(cè)器被稱(chēng)為EMCCD（(electron multiplying CCD，電子倍增CCD）。

4.7電子倍增CCD——EMCCD

EMCCD是一個(gè)普通的CCD，帶有一個(gè)額外的讀出寄存器，其驅(qū)動(dòng)的時(shí)鐘電壓比普通的CCD讀出寄存器高得多。由于這個(gè)高的時(shí)鐘電壓，通過(guò)沖擊電離實(shí)現(xiàn)了電子倍增，信號(hào)的總放大倍數(shù)可到1000倍。

當(dāng)載流子在讀出寄存器中從一個(gè)像素轉(zhuǎn)移到另一個(gè)像素時(shí)，產(chǎn)生多余載流子的概率極低（最大1.0043），但由于這個(gè)過(guò)程要重復(fù)1600次，總放大倍數(shù)可以高達(dá)1.00431600=1000。這樣，總是可以把信號(hào)放大到讀出噪聲以上，這樣信噪比總是受到信號(hào)的泊松噪聲的限制，即使使用非?？斓淖x出放大器。這時(shí)的信號(hào)被稱(chēng)為射出噪聲限制。

舉個(gè)例子，一個(gè)1600 x200像素的EMCCD，使用2.5MHz的讀出放大器，可以在1.3ms內(nèi)讀出（760光譜/s），而不會(huì)像普通CCD那樣受到讀出噪聲的限制。

如果將讀出限制在CCD芯片的幾條線(xiàn)上，甚至有可能超過(guò)1300個(gè)光譜/秒。

如果信號(hào)不受讀出噪聲的支配（大信號(hào)，長(zhǎng)積分時(shí)間），就可以使用"正常"的讀出寄存器，EMCCD的行為就像最先進(jìn)的背照式CCD。

盡管EMCCD相機(jī)非常敏感，能夠檢測(cè)單光子，但它不能被用作單光子檢測(cè)裝置，因?yàn)樗狈σ粋€(gè)鑒別器。EMCCD與標(biāo)準(zhǔn)CCD相比，可提高信噪比，特別是對(duì)于非常低的信號(hào)水平和快速讀出。圖4顯示了EMCCD與傳統(tǒng)CCD相比，在4、10和35電子讀出噪聲（33、100kHz和2.5MHz讀出速度）下計(jì)算出的信噪比與信號(hào)（每像素光子）的關(guān)系。

圖4背照式EMCCD探測(cè)器的信噪比與傳統(tǒng)背照式CCD相機(jī)比，不同的讀出噪聲水平（4、10和35電子），慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）。箭頭表示，在不同的讀出噪聲水平下，EMCCD的信噪比超過(guò)傳統(tǒng)探測(cè)器的光子數(shù)量（18、111、1362）。

圖5與傳統(tǒng)的背照式CCD相機(jī)相比，背照式EMCCD探測(cè)器在不同的讀出噪聲水平（4、10和35電子）下信噪比的提高，這是典型的慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）讀出速度與每像素光子的關(guān)系。

4.8EMCCD的實(shí)測(cè)案例

樣品是一個(gè)旋涂在玻璃基底上的超薄聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）薄膜。該層被劃傷，并在樣品的一些區(qū)域去除了PMMA。樣品層的高度由原子力顯微鏡AFM確定為7.1nm。此外，在表面發(fā)現(xiàn)了一個(gè)針狀的污染，厚度為4.2nm。這個(gè)污染層的來(lái)源和材料組成最初并不清楚，但可以通過(guò)共焦拉曼測(cè)量來(lái)確定。

圖6是通過(guò)在50x50 μm的掃描范圍內(nèi)獲取200 x200個(gè)拉曼光譜，并對(duì)PMMA的CH拉伸帶的強(qiáng)度在3000 rel. cm?1左右進(jìn)行積分得到。激發(fā)功率為20 mW @532 nm，使用100×，NA為0.9的物鏡。

圖6玻璃上7.1nm PMMA層的共焦拉曼圖像在2950 rel. cm?1左右的CH拉伸帶處獲得。a背照射式CCD。b, c EMCCD。比例尺10 μm。d樣品示意圖

圖7拉曼光譜（左圖）。玻璃（藍(lán)色）上7.1 nm PMMA層（紅色）和4.2 nm污染層（綠色）的共焦拉曼圖。200x200張光譜，每張光譜7毫秒的積分時(shí)間?？偛杉瘯r(shí)間：5.4分鐘。（右圖）

從圖7可以看出，玻璃基底有一個(gè)小的拉曼帶，其信號(hào)是PMMA信號(hào)的一半，而在完全相同的區(qū)域有3倍的烷烴信號(hào)。很明顯，拉曼系統(tǒng)的共焦性對(duì)于研究薄層是至關(guān)重要的。

即使有最好的共焦設(shè)置，信息深度也至少是500nm，這意味著500nm的玻璃對(duì)拉曼信號(hào)有貢獻(xiàn)。由于拉曼信號(hào)與材料的數(shù)量成正比，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的（非焦距）設(shè)置會(huì)收集到超過(guò)300倍的玻璃信號(hào)（170微米的玻璃蓋板厚度），使得對(duì)薄涂層的探測(cè)成為不可能，即使有更長(zhǎng)的積分時(shí)間。

5結(jié)論

共焦拉曼成像是一種強(qiáng)大的技術(shù)，在各種科學(xué)領(lǐng)域都有應(yīng)用。共焦性可以抑制不需要的熒光背景以及來(lái)自基底的背景，還可以以一定深度分辨率進(jìn)行深度掃描。由于圖像中存在大量的光譜，每個(gè)光譜的積分時(shí)間必須保持盡可能短。因此，系統(tǒng)的通量非常關(guān)鍵，高通量光譜有助于獲得高質(zhì)量光譜。

使用EMCCD，即使在極低的信號(hào)水平下，光譜也可以保持近乎射出噪聲的限制。相比最好的CCD，EMCCD可以使信噪比提高10倍以上，而對(duì)于較大的信號(hào)，可以關(guān)閉EMCCD，并保留標(biāo)準(zhǔn)背照式CCD的所有特性。

玻璃基底上7.1nm的PMMA以及4.2nm烴層的分布可以很容易被EMCCD探測(cè)和識(shí)別，每個(gè)光譜的積分時(shí)間僅為7毫秒。這使得200X200 (=40,000)個(gè)光譜的共焦拉曼圖像的總體采集時(shí)間減少到僅為5.4分鐘。在532nm激發(fā)下，使用NA=1.4的油浸物鏡，該共焦圖像的衍射限制空間分辨率為230nm。