在生物醫(yī)學(xué)研究中，動物模型的重要性不言而喻。其中，小鼠是使用較多的模型之一。大多數(shù)小鼠在研究時的年齡在4周到20周之間，但是并沒有系統(tǒng)性的研究揭示年齡和性別對模型生理和病理的影響，忽略了年齡和性別水平上潛在的分子差異。因此，本文作者利用4D質(zhì)譜技術(shù)深度解析了不同年齡的雌雄小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)的蛋白質(zhì)表達差異，為臨床前研究提供了有價值的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)資源。

研究內(nèi)容

1、DIA-PASEF 可對小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)進行深度可重復(fù)的蛋白質(zhì)組分析

本研究中，研究者分析了不同年齡（4周和14周）以及不同性別（雄性和雌性）共16只小鼠爪部皮膚和坐骨神經(jīng)（SCN）的蛋白質(zhì)組學(xué)差異。研究者首先比較了兩種labelfree定量蛋白質(zhì)組檢測策略，即DDA和DIA的檢測效果。使用混合皮膚多肽和SCN多肽作為質(zhì)量控制（QC），用DIA模式計算了所有QC樣品的pearson相關(guān)系數(shù)。

混合皮膚和SCN的平均相關(guān)性分別為0.98和0.99，表明儀器設(shè)置的一致性和穩(wěn)定性。通常情況下，DIA數(shù)據(jù)是根據(jù)同一樣本DDA數(shù)據(jù)構(gòu)建的肽文庫進行搜索的，因此，只能識別和量化文庫中存在的蛋白質(zhì)。而DIA-NN，一個最近開發(fā)的基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的程序，無需構(gòu)建肽文庫而是直接搜索的方式廣泛地改進了DIA的分析流程。

研究者使用MaxQuant分析DDA數(shù)據(jù)，用DIA-NN無文庫分析DIA數(shù)據(jù)并進行比較，發(fā)現(xiàn)DIA高度覆蓋了DDA的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，DIA模式下比DDA在皮膚和SCN中檢測到額外的4135和3926個蛋白質(zhì)groups（后文省略groups）。DIA結(jié)果的變異系數(shù)（CV）更小，表明該模式比DDA重復(fù)性更高。因此，研究者使用DIA結(jié)果用于進一步研究。

Fig.1 DIA-PASEF在分析小鼠爪部皮膚和SCN蛋白質(zhì)組時優(yōu)于DDA-PASEF

2、小鼠爪部皮膚和SCN中蛋白質(zhì)豐度的年齡差異

研究者在小鼠爪部皮膚中鑒定到蛋白質(zhì)超過8600個，包括所有 50 種已知的角蛋白和 19 種膠原蛋白、白細胞介素 (IL) 家族的 13 個成員和 S100 家族的 11 個成員。在SCN中，鑒定到約8400個蛋白質(zhì)，包含約94%的髓磷脂蛋白質(zhì)。此外，SCN中還鑒定到離子通道蛋白（如Trpv1等）。

由于離子通道蛋白豐度較低及其疏水性很難被質(zhì)譜檢測到，側(cè)面表明Tims TOF DIA檢測蛋白質(zhì)的深度和高性能。主成分分析（PCA）將樣品按年齡區(qū)分開，無論是在爪部皮膚還是SCN中，這說明年齡是一個突出的鑒別因素。對鑒定到的蛋白質(zhì)進行模糊C均值聚類分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)表達模式與年齡具有強關(guān)聯(lián)性，一部分蛋白質(zhì)在年齡／性別組中表現(xiàn)出不同的表達趨勢。

例如，皮膚蛋白質(zhì)組cluster 6中的大多數(shù)蛋白質(zhì)在雌性中顯示出輕微的年齡依賴性變化，而與4周齡雄性相比，14周齡雄性的豐度顯著增加。這些結(jié)果表明，爪部皮膚和SCN的部分蛋白質(zhì)表達模式存在性別和年齡的特異性，這可能會影響小鼠的生理/病理狀態(tài)。

Fig.2 爪子皮膚和SCN蛋白質(zhì)組的年齡和性別差異

3、爪部皮膚中生物學(xué)通路的年齡與性別差異

為進一步探究蛋白表達與年齡的相關(guān)性，研究者篩選了|log2FC>=0.585|且q-value<=0.05的蛋白質(zhì)作為差異蛋白（DEP），在雌性和雄性的結(jié)果中各找到234和94個皮膚DEP，其中46個同時存在于2個性別組中。對這46個DEP進行GO富集分析（BP方向）發(fā)現(xiàn)了3個顯著的條目。

與14周相比，4周的皮膚組富集了與皮膚發(fā)育相關(guān)的途徑，如“蛋白質(zhì)羥化”和“膠原纖維組織”，幾種脯氨酸/絲氨酸羥化酶和膠原蛋白成員在4周組中上調(diào)表達。對雄性和雌性組的DEP分別進行GO-BP富集分析發(fā)現(xiàn)，在雄性皮膚中，“缺口信號”和“外在凋亡信號”條目在4周時顯著豐富，而“肌動蛋白介導(dǎo)的細胞收縮”和“參與形態(tài)發(fā)生的細胞成分組裝”在 14周時顯著豐富。在雌性皮膚中，與4周相比，14周時顯著富集了多個有助于皮膚穩(wěn)態(tài)的條目。

Fig.3 爪部皮膚樣本的差異表達分析揭示了雄性和雌性小鼠不同的年齡相關(guān)的生物學(xué)通路

4、SCN 中免疫通路和髓磷脂蛋白的年齡與性別差異

在雌性和雄性SCN中，根據(jù)年齡進行差異比較分析，各發(fā)現(xiàn)929和1269個DEP。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，在兩種性別中的共有DEP中，“囊泡定位”在4周的Z分數(shù)更高，而與“神經(jīng)元存活”、“神經(jīng)遞質(zhì)運輸”和“順行軸突運輸”相關(guān)通路在14周更顯著。

在SCN結(jié)果中，搜索已知在免疫細胞中表達的神經(jīng)元受體的配體蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)有19個蛋白在兩種性別中都表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的豐度差異。研究者根據(jù)這些結(jié)果提出一個假設(shè)，即在年幼小鼠的SCN中存在一種特殊的動態(tài)平衡機制，可在受體水平上平衡配體的豐度。

髓鞘蛋白質(zhì)中有21種的豐度受年齡調(diào)節(jié)，包括高豐度的結(jié)構(gòu)髓鞘蛋白，如MBP和MPZ。MBP和MPZ在14周的雄性和雌性SCN中都上調(diào)表達，反映了髓鞘組裝和軸突隨年齡的發(fā)育。然而，一些與年齡相關(guān)的髓鞘DEP是性別特異性的。進一步研究這些與性別和年齡相關(guān)的變化可能有助于更好地了解髓鞘的分子結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的病理。

Fig.4 不同年齡SCN樣品的差異表達分析

5、不同年齡組爪部皮膚和SCN蛋白質(zhì)組的性別二態(tài)性

接下來，研究者研究了4周和14周時雄性和雌性組的蛋白質(zhì)表達差異，并在皮膚和SCN中分別找到58個和33個DEP，并且它們在4周和14周的性別差異有明顯不同。與14周相比，4周的變化不明顯。在4周的SCN中沒有找到任何DEP。GO-BP富集分析發(fā)現(xiàn)在14周皮膚和SCN的性別比較結(jié)果中，“補體激活調(diào)節(jié)”顯著富集。補體系統(tǒng)與免疫、宿主防御、炎癥和相關(guān)病理學(xué)密切相關(guān)，因此，這種性別二態(tài)性會為今后的研究，特別是使用嚙齒動物疾病模型的實驗設(shè)計提供重要指導(dǎo)。

Fig.5 差異表達分析揭示爪部皮膚和SCN中蛋白質(zhì)特征的性別差異

6、與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)具有年齡與性別差異

研究者將人皮膚病轉(zhuǎn)錄圖譜數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)反向翻譯成小鼠數(shù)據(jù)，并和自己的結(jié)果進行比較，找到了907個致病基因中的329個。其中27個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的年齡和/或性別差異。對這329個皮膚病相關(guān)蛋白的聚類分析不僅揭示了年齡和性別組之間的離散豐度模式，而且當比較四個組時發(fā)現(xiàn)了不同表達模式的蛋白質(zhì)。

Cluster6的蛋白質(zhì)在14周的雄性皮膚豐度更高；而與14周相比，cluster7的蛋白質(zhì)在4周的皮膚中豐度較低。轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 (Sp1) 和多功能蛋白聚糖核心蛋白 (Vcan) 在4周雌性皮膚的豐度較低（與14周雌性相比）。轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)蛋白 ig-h3 (Tgfbi) 和Sp1在 14 周的雌性皮膚中豐度更高，但在雄性中沒有發(fā)現(xiàn)類似的顯著差異。這些結(jié)果表明，人類皮膚病相關(guān)蛋白的表達在小鼠中受到年齡和性別影響，這對皮膚反向翻譯研究具有極其重要的意義。

SCN 受到各種病理的影響，例如神經(jīng)損傷和神經(jīng)性疼痛，在這種情況下，研究者通過與三個公開可用的疼痛基因數(shù)據(jù)庫進行比較，評估了 SCN 數(shù)據(jù)集中已知疼痛相關(guān)基因的蛋白表達水平。在 841 個疼痛基因中，有 245 個在我們的 SCN 蛋白質(zhì)組中被定量檢測到，并且這245個疼痛相關(guān)蛋白的豐度分布因年齡和/或性別而異。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Ace)表現(xiàn)出明顯的年齡和性別差異，而其家族成員Ace2只顯示出年齡差異(即在成年小鼠中表達較高)。FK506結(jié)合蛋白51(Fkbp5)也顯示出顯著的年齡和性別差異，與4周小鼠相比，其在雌性成年小鼠中的表達較低，而在雄性成年小鼠中的表達較高。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)豐度在不同年齡和性別中的變化對于臨床前疾病模型研究的重要性。綜上所述，本研究的數(shù)據(jù)結(jié)果強調(diào)了性別與年齡匹配的平行性生物醫(yī)學(xué)研究的必要性。

Fig.6 與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)表達受年齡和/或性別影響

結(jié)果總結(jié)

本研究采用優(yōu)化的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，深入剖析小鼠爪部皮膚和SCN這兩個組織與傷害性和疼痛，以及與炎癥、損傷和脫髓鞘相關(guān)疾病的關(guān)系。研究者的分析揭示了與小鼠年齡和/或性別相關(guān)的蛋白質(zhì)亞群和網(wǎng)絡(luò)，其中包括已知的(病理)生理相關(guān)的蛋白質(zhì)/生物通路，比如皮膚中的動態(tài)平衡和表皮信號，以及在SCN中，多髓鞘蛋白和神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)節(jié)因子。

與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，與皮膚病和疼痛相關(guān)的多種蛋白質(zhì)表達水平顯著受到年齡和/或性別影響，揭示了蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)水平上迄今未知的性別和年齡差異。

審核編輯：劉清