納米酶傳感器陣列是一種利用納米酶的酶促活性同時區(qū)分多種物質(zhì)的方法。與大型儀器不同，陣列檢測通常能夠在單次分析中區(qū)分多種目標(biāo)物。納米酶通常由金屬中心和配體組成，并且常常表現(xiàn)出多種類酶活性，這使其能夠?qū)Χ喾N底物產(chǎn)生響應(yīng)，并實現(xiàn)對多種底物的同時檢測。然而，多種類酶活性的存在可能會導(dǎo)致干擾，進(jìn)而降低檢測過程的準(zhǔn)確性。例如，過氧化物酶和過氧化氫酶都對底物H?O?有響應(yīng)，氧化酶和過氧化物酶都對底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）有響應(yīng)。因此，在檢測目標(biāo)物時，無法確定是哪種類酶活性導(dǎo)致了觀察到的結(jié)果。所以，制備一種具有多種類酶活性、且能根據(jù)檢測需要對單一底物產(chǎn)生特定響應(yīng)的檢測方法是一種有效的解決方案。

為了減少多種類酶活性帶來的干擾，研究人員通常會改變外部環(huán)境或合成功能性納米酶。例如，Guopeng Xu通過激光能量控制反應(yīng)的能壘來激發(fā)不同的類酶活性。Guojian Wu合成了由多功能可視化分子印跡驅(qū)動的可切換活性納米酶。Chu Wang通過用不同的手性配體修飾納米酶實現(xiàn)了選擇性檢測。然而，由于檢測時間和場地的限制，這種復(fù)雜的調(diào)控在食品的現(xiàn)場檢測中可能并不適用。因此，開發(fā)一種能夠展現(xiàn)多種類酶活性且能快速切換底物的納米酶，對于食品分析至關(guān)重要。

茶多酚含有大量的酚羥基，這些酚羥基具有抗氧化和清除自由基的特性，因此與氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)。同時，茶多酚是茶葉中的重要活性成分，也是區(qū)分茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。納米酶的底物通常與氧化還原反應(yīng)有關(guān)。因此，將茶多酚作為基于可切換底物納米酶傳感器陣列的檢測目標(biāo)具有重要的研究價值。通過改變條件，茶多酚和不同的氧化還原底物可以獨立發(fā)揮作用，從而實現(xiàn)對茶多酚的精確區(qū)分，并進(jìn)而評估茶葉品質(zhì)。

設(shè)計原理

在這項工作中，我們利用ZIF-8模板合成了一種具有多種類酶活性的三金屬納米酶（CuMnZn）。該納米酶被設(shè)計為在特定條件下對單一底物產(chǎn)生最佳響應(yīng)，從而避免了多種類酶活性之間的相互干擾問題。如方案1所示，通過調(diào)節(jié)pH值，可分別在酸性、近中性和堿性條件下實現(xiàn)對三種底物的單一響應(yīng)。在每個相應(yīng)的pH條件下，該納米酶能對各自的底物產(chǎn)生最佳響應(yīng)，同時抑制對其他底物的響應(yīng)。最后，基于茶多酚能對這三種底物產(chǎn)生響應(yīng)的特性，我們將其應(yīng)用于茶多酚的區(qū)分和檢測。在機器學(xué)習(xí)的輔助下，我們能夠在室溫下短時間內(nèi)（5分鐘）100%準(zhǔn)確區(qū)分二級和非一級產(chǎn)地的綠茶，具有良好的應(yīng)用前景。

方案1.機器學(xué)習(xí)輔助的用于茶葉品類識別的可切換納米酶反應(yīng)陣列示意圖。

數(shù)據(jù)介紹

圖1.三金屬納米酶的表征。(A)三金屬納米酶的制備過程。(B)三金屬納米酶的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。(C)三金屬納米酶的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）。(D)三金屬納米酶的X射線光電子能譜全譜，以及(E)三金屬納米酶的Mn 2p光譜。(F)三金屬納米酶的元素含量比例。

圖2.納米酶類酶活性研究。(A)類氧化酶活性。(B)類多酚氧化酶活性。(C)類過氧化氫酶活性。(D)類過氧化物酶活性。(E)類葡萄糖氧化酶活性。(F)反應(yīng)進(jìn)程與反應(yīng)時間的關(guān)系。

研究觀察到，三金屬納米酶對TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）和酚類物質(zhì)具有良好的氧化能力，并且能夠催化分解過氧化氫（H2O2），同時受到其他類酶活性的干擾極小。如圖2A所示，納米酶氧化TMB的能力通過TMB從無色變?yōu)樗{(lán)色得以證明。如圖2B所示，納米酶氧化酚類的能力表現(xiàn)為無色的2,4 -二氯苯酚（2,4-DP）與4 -氨基吡啶（4-AP）結(jié)合后變?yōu)樽仙Ｈ鐖D2C所示，納米酶的類過氧化氫酶活性可通過其分解H2O2的能力得以證實，這使得在TMB和天然辣根過氧化物酶存在的情況下，反應(yīng)體系不會顯色。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在H2O2存在的情況下，納米酶對TMB氧化能力的增強作用極小，這表明其類氧化酶活性優(yōu)于類過氧化物酶活性（圖2D）。茶葉中含有一定量的葡萄糖，為探究葡萄糖是否會干擾茶多酚的檢測，研究對納米酶氧化底物葡萄糖的情況進(jìn)行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米酶幾乎無法氧化葡萄糖生成H2O2，而H2O2會使TMB變藍(lán)（圖2E）。動力學(xué)數(shù)據(jù)表明，與傳統(tǒng)納米酶相比（表S1和S2），三金屬納米酶表現(xiàn)出較高的最大反應(yīng)速率（Vmax）和較低的米氏常數(shù)（Km）（圖S1）。結(jié)果顯示，所有三種底物（TMB、酚類和H2O2）在5分鐘時反應(yīng)達(dá)到最大值（圖2F）。這表明該納米酶對底物具有強烈的響應(yīng)。

圖3. (A)不同pH值對不同反應(yīng)底物的影響。(B)制備比例對納米酶活性的影響。(C)不同pH值下TMB底物的動力學(xué)表征。(D)三種納米酶底物反應(yīng)的實際圖像。(E)不同pH值下2,4 -二酚（2,4-DP）底物的動力學(xué)表征。(F)不同pH值下H2O2底物的動力學(xué)表征。

為了在不同pH條件下實現(xiàn)對不同底物的特異性響應(yīng)，研究人員探究了納米酶在不同pH值下的活性。觀察發(fā)現(xiàn)，三種底物（TMB、苯酚和H2O2）的響應(yīng)明顯依賴于pH值的變化。納米酶對TMB的氧化作用主要集中在酸性條件下，在pH值為4時氧化能力最強，在接近中性時氧化作用消失。納米酶對苯酚的氧化在中性條件下最為顯著，在酸性和堿性條件下則明顯減弱。相比之下，類過氧化氫酶活性僅在堿性條件下才能觀察到（圖3A）。利用圖像的可視化表示有助于闡明底物反應(yīng)的趨勢（圖3D）。值得注意的是，在每個pH轉(zhuǎn)換條件下，相應(yīng)底物的響應(yīng)最佳，而另外兩種底物的響應(yīng)極小，從而確保了多種類酶活性檢測的準(zhǔn)確性。隨后，對三金屬的制備比例進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)比例為1:6時，納米酶具有最佳的類酶活性和底物切換響應(yīng)（圖3B）。研究人員還探究了模板對納米酶的作用。模板可以提高三金屬納米酶的分散性（圖S2），當(dāng)模板濃度（鋅濃度）在0.02 - 0.1M時，類酶活性更強（圖S3）。但只有在模板濃度為0.1M時，納米酶才能實現(xiàn)底物切換的功能（圖3D）。此外，該納米酶還表現(xiàn)出出色的穩(wěn)定性（圖S4）和對常見離子的耐受性（圖S5）。通過動力學(xué)分析研究了pH值對底物響應(yīng)的變化情況。如圖3C所示，在酸性條件（pH為4）下，納米酶對底物TMB表現(xiàn)出優(yōu)異的動力學(xué)性能，然而，在中性和堿性條件下改變TMB濃度時，TMB的氧化速率變化極小，導(dǎo)致動力學(xué)性能欠佳。同樣地，納米酶僅在pH為6.5（圖3E）和8.5（圖3F）時，對苯酚和H2O2表現(xiàn)出最佳動力學(xué)性能，在其他pH值下動力學(xué)性能會有所下降。

圖4. (A)不同類型茶多酚對TMB顯色抑制作用的影響。(B)不同類型茶多酚與納米酶類多酚氧化酶活性的反應(yīng)情況。(C)不同類型茶多酚對類過氧化氫酶活性的影響。(D)單一茶多酚組分的指紋圖譜。(E)兩種茶多酚混合物組分的指紋圖譜。(F)三種茶多酚混合物組分的指紋圖譜。(G)濃度為100、50、20和2 μM的茶多酚的線性判別分析（LDA）圖。(H)濃度為100、50、20和2 μM的茶多酚的層次聚類分析（HCA）圖。

不同的茶多酚因其酚羥基數(shù)量不同，具有不同的抗氧化能力。在此，我們以不同的茶多酚為底物，研究納米酶與茶多酚之間的關(guān)系。此外，它們能與所有三種底物發(fā)生相互作用，這使得它們成為該檢測方法的理想檢測目標(biāo)。如圖4A、4B和4C所示，八種茶多酚對TMB顯色的抑制作用各不相同，與4-AP結(jié)合后的顯色情況也明顯不同，并且對H2O2分解的抑制作用也有所差異?；谶@些觀察結(jié)果，我們設(shè)計了一種三通道納米酶陣列檢測方法，用于檢測和區(qū)分不同種類的茶多酚。這三個通道在三種pH值條件下分別只對各自的底物產(chǎn)生響應(yīng)，避免了干擾，確保了檢測的準(zhǔn)確性。

納米酶反應(yīng)在652nm、500nm和450nm處的吸光度值被用作區(qū)分八種茶多酚的依據(jù)。通過繪制不同茶多酚對三個通道響應(yīng)的指紋圖譜，我們能夠深入了解它們之間的相互作用（圖4D）。沒食子酸（GA）和表沒食子兒茶素（EGC）對TMB抑制和H2O2自由基清除通道的影響較大，這可歸因于它們的鄰三酚結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它們顯著的抗氧化和自由基清除能力 。在酚類顯色通道中，表兒茶素（EC）和兒茶素（CC）由于其鄰二酚結(jié)構(gòu)易被氧化，因此會引發(fā)更明顯的響應(yīng) 。

在這三個通道中，茶多酚表現(xiàn)出不同的特征，而茶葉中的其他干擾物質(zhì)沒有響應(yīng)，這表明以這種方式構(gòu)建陣列來區(qū)分茶多酚是可行的。對濃度為100μM的數(shù)據(jù)集（3個傳感器通道×8種茶多酚×6個平行樣本）進(jìn)行進(jìn)一步的線性判別分析（LDA）表明，這八種茶多酚能夠被有效區(qū)分，且相互之間沒有重疊（圖4G）。隨后進(jìn)行的無監(jiān)督層次聚類分析（HCA）算法（圖4H）顯示，每種茶多酚也都能很好地聚為一類，這表明該陣列能夠高精度地區(qū)分茶多酚。為了進(jìn)一步驗證傳感器的性能，對低濃度（50、20、10、5和2μM）的樣本也進(jìn)行了區(qū)分，結(jié)果很成功（圖4G、圖S6A和圖S6C）。在HCA算法下，所有樣本也都能很好地分離并正確分類（圖4H、圖S6B和圖S6D）。這使得傳感器陣列能夠區(qū)分濃度在2μM至100μM之間的任何茶多酚種類。此外，該傳感器具有強大的抗干擾能力，能夠100%準(zhǔn)確地識別和區(qū)分多種常見的干擾物質(zhì)（圖S7）?？紤]到茶多酚成分的內(nèi)部變異性，制備了一系列隨機混合的茶多酚，以模擬天然樣品中的復(fù)雜性。我們進(jìn)一步使用二元和三元混合茶多酚樣品（圖4E和4F）驗證了傳感器的性能，發(fā)現(xiàn)這些樣品能夠100%被區(qū)分開（圖S8A和S8C），并且通過層次聚類分析（HCA）算法能夠正確分類（圖S8B和S8D）。這表明，這種可切換底物的比色陣列在區(qū)分茶多酚方面具有出色的能力。

圖5. (A)判別分析模型流程圖。(B)幾種算法正確率的比較。(C)隨機種子與正確率之間的關(guān)系。(D)隨機劃分的訓(xùn)練集和測試集的熱圖。(E)隨機森林處理后訓(xùn)練數(shù)據(jù)的混淆矩陣，以及(F)測試數(shù)據(jù)的混淆矩陣 。

鑒于真實茶葉樣品中各種茶多酚的濃度各不相同，研究如何在忽略這些濃度差異的情況下區(qū)分茶多酚是一項有價值的工作。通過比較多種算法的準(zhǔn)確性，隨機森林模型被確定為區(qū)分效果最佳的模型，它能夠?qū)崿F(xiàn)100%的區(qū)分度（圖5B）。隨機森林算法是一種基于集成學(xué)習(xí)的機器學(xué)習(xí)算法，它通過結(jié)合多個決策樹的預(yù)測結(jié)果來提高模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性。多個決策樹的構(gòu)建增強了傳感器陣列的泛化能力。進(jìn)一步的研究表明，隨機種子的選擇會影響區(qū)分的準(zhǔn)確性。因此，本研究選擇4作為隨機數(shù)（圖5C）。將同一種茶多酚的所有濃度樣本歸為一組，最終得到了包含八個標(biāo)簽的數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集按照8:2的比例被劃分為訓(xùn)練集和測試集，目的是在忽略濃度影響的情況下進(jìn)行區(qū)分（圖5A）。一般的流程是使用劃分好的訓(xùn)練集構(gòu)建模型，然后將其應(yīng)用到測試集中，以評估模型準(zhǔn)確區(qū)分的能力。該模型能夠從輸入的訓(xùn)練集中自動學(xué)習(xí)，并100%準(zhǔn)確地區(qū)分所有樣本。數(shù)據(jù)在模型的對角線上聚集，這表明模型的真實值與預(yù)測值是一致的（圖5E）。測試集中100%的區(qū)分度也證實了這一點，這證明了模型構(gòu)建的準(zhǔn)確性（圖5F）。色差圖更直觀地展示了不同類型茶多酚在不同濃度之間的差異（圖5D）?？傊?，隨機森林模型在不考慮濃度的情況下區(qū)分樣本時，準(zhǔn)確性有了顯著提高，這有利于區(qū)分更復(fù)雜的樣本模型。

圖6. (A)八種茶多酚的線性回歸分析。(B)茶葉品種的隨機森林判別結(jié)果。(C)摻假茶葉品種的實物圖。(D)摻假茶葉品種的隨機森林判別結(jié)果。

通過成功忽略茶多酚的濃度差異，我們再次實現(xiàn)了對多種茶多酚的回歸定量預(yù)測，這使得該傳感器陣列在實際樣品檢測中展現(xiàn)出卓越的區(qū)分能力。首先，利用最小二乘線性回歸模型對八種茶多酚進(jìn)行了定量分析，這有助于更詳細(xì)地分析茶葉樣品。每種茶多酚的預(yù)測值與真實值之間的線性關(guān)系具有高度相關(guān)性（R2值超過0.93），并且測試集的數(shù)據(jù)與預(yù)測模型高度吻合（圖6A）。為了評估傳感器陣列在實際環(huán)境中的適用性，我們選取了多種不同產(chǎn)地和質(zhì)量等級的市售綠茶進(jìn)行分析。每種茶葉取0.5克，加入20毫升純凈水，將溶液加熱至80℃并保持20分鐘。沖泡后的茶湯用0.5毫米孔徑的注射器過濾，然后稀釋10倍。如圖6B所示，這些樣品能夠被有效區(qū)分，即使存在幾種常見物質(zhì)，傳感器陣列仍能實現(xiàn)100%的區(qū)分度。這表明該傳感器陣列在實際應(yīng)用中不僅具有出色的區(qū)分能力，還具備一定程度的抗干擾能力（圖S9）。

最后，我們將非一級產(chǎn)地的普通茶葉混入一級產(chǎn)地的特種茶葉中（分別標(biāo)記為AD1至AD6），模擬市場上常見的摻假樣品。如圖6C所示，紅色方框表示人工摻假的不合格茶葉。僅通過外觀特征很難辨別摻假樣品，尤其是在沒有專業(yè)儀器的情況下。然而，通過傳感器陣列結(jié)合隨機森林模型進(jìn)行分析，可以直觀地呈現(xiàn)區(qū)分結(jié)果，并高精度地識別出摻假樣品（圖6D）。這表明，基于具有可切換底物的三通道傳感器陣列，并借助機器學(xué)習(xí)，該方法可用于復(fù)雜樣品的分析，同時能夠區(qū)分茶葉的產(chǎn)地和等級，具有廣泛的潛在應(yīng)用價值。

總結(jié)

總之，我們合成了一種具有多種類酶活性的三金屬納米酶，它在不同pH值下對單一底物表現(xiàn)出最佳響應(yīng)，而對其他底物無響應(yīng)。我們開發(fā)了一種精確的三通道比色傳感器陣列，包含三種可切換的底物，即3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、酚類物質(zhì)和H?O?，該陣列具有抗干擾性?；诓煌目寡趸⒀趸@色和抑制自由基的能力，該傳感器陣列成功地對八種茶多酚進(jìn)行了區(qū)分。同時，機器學(xué)習(xí)有助于區(qū)分與濃度無關(guān)的數(shù)據(jù)，這有利于復(fù)雜樣品的識別并展現(xiàn)出抗干擾能力。此外，該陣列在實際樣品中具有100%的識別能力，能夠區(qū)分摻假來源和等級的茶葉樣品。納米酶不僅具有多種類酶活性，還具備切換底物響應(yīng)的能力，這有助于實現(xiàn)無干擾檢測。這些研究結(jié)果對功能性納米酶的制備及其在傳感器陣列中的合理應(yīng)用具有重要意義。

來源：微納傳感

https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162447